三葉青毛狀根的誘導及其液體培養(yǎng)體系的研究

　　摘要： 為建立三葉青毛狀根的誘導和液體培養(yǎng)體系，采用發(fā)根農桿菌株系C58C1和ATCC15834進行毛狀根的誘導，通過無菌三葉青葉片預培養(yǎng)、浸染、共培養(yǎng)、篩選、形態(tài)和PCR鑒定等過程獲得三葉青毛狀根根系，并對三葉青毛狀根和兩年生塊根總黃酮進行比較分析。試驗結果表明，發(fā)根農桿菌C58C1能從三葉青葉片誘導出毛狀根，三葉青毛狀根在不添加生長素的1/2MS液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，其總黃酮含量約是2年生三葉青塊根的1/5。

　　關鍵詞： 三葉青; 毛狀根; C58C1; 黃酮; 液體培養(yǎng)

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　　三葉青(Tetrastigma hemsleyanum) 是葡萄科崖爬藤屬植物，俗名金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠等，為我國特有珍稀藥用植物，全草可入藥，以地下塊根最佳[ 1， 2 ]。近些年來，三葉青塊根被發(fā)現(xiàn)具有低毒和抗癌特性[ 3 - 10 ]，自然資源遭到規(guī)模化人為破壞[ 11 - 12 ]。三葉青自然生長條件苛刻，生長緩慢，人工栽培技術還不成熟，難以滿足快速增長的市場需求。盡管人們對三葉青進行了微繁和細胞培養(yǎng)研究，但規(guī)模化應用明顯不足[ 13 - 14 ]。另一方面，人們在三葉青塊根中發(fā)現(xiàn)了大量的黃酮類物質[ 15 - 19 ]，但一直沒有確定其主效成分。毛狀根具有生長速度快、遺傳穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短、條件可控等優(yōu)點，可為植物次生代謝產物的規(guī)模生產、作物品種改良、環(huán)境修復以及相關理論的研究提供快捷的培養(yǎng)體系[ 20 ]。當前，對于三葉青毛狀根的研究還較少[ 21 ]，為了解決這些問題，本研究建立了三葉青毛狀根的誘導程序，初步建立了其液體培養(yǎng)體系，為三葉青毛狀根培養(yǎng)、次生代謝物合成和代謝機理研究奠定了基礎，同時希望起到保護三葉青野生資源的作用。

　　1 試驗材料

　　三葉青苗(浙江理工大學植物學副教授楊宗岐博士鑒定)由杭州市三葉青農業(yè)科技有限公司提供，根據王靜等人[ 22 ]的方法獲得無菌試管苗。發(fā)根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株C58C1和ATCC15834由本實驗室保存。

　　2 試驗方法

　　2. 1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

　　采用MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基[ 23 ]，并進行微調。毛狀根誘導體系用培養(yǎng)基：(1)發(fā)根農桿菌培養(yǎng)基YEB：牛肉浸膏5 g·L-1、 酵母浸膏1 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、MgSO4·H2O 0.5 g·L-1，pH：7.0～7.2。(2)葉片浸染液體培養(yǎng)基(ILD)(工作液濃度單位：mg·L-1，下同)：MS+6-BA(6-卞基胺基嘌呤，6-Benzylaminopurine)2+NAA(萘乙酸，1-naph- thylacetic acid)0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，滅菌后冷至室溫，加AS 25。(3)葉片預培養(yǎng)培養(yǎng)基(PCM)：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH=5.8，植物凝膠2.7 g·L-1。(4)共感染培養(yǎng)基(CID)：MS+6-BA 2+

　　NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.2～5.4，植物凝膠2.7 g·L-1，滅菌后加AS 25。(5)除菌培養(yǎng)基(DM)：MS+6-BA 2+NAA 0.5，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，特美汀(Timentin，Ti)200，頭孢(Cefixime，cef)200。(6)毛狀根篩選培養(yǎng)基(SM1)：MS+NAA 0.3，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200。(7)毛狀根繼代培養(yǎng)基(SCD1)：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1，Ti 200，cef 200;(8)毛狀根繼代培養(yǎng)基(SCD2)：MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0，植物凝膠2.7 g·L-1。(9)毛狀根液體懸浮培養(yǎng)基(LSD)：1/2MS，蔗糖30 g·L-1，pH：5.8～6.0。所有培養(yǎng)基經115 ℃，15 min滅菌，培養(yǎng)基降溫至60 ℃以下時添加抗生素和AS。三葉青毛狀根誘導培養(yǎng)和固體培養(yǎng)條件為25±2 ℃，暗培養(yǎng);三葉青毛狀根液體培養(yǎng)條件為25 ℃，轉速110 r/min，暗培養(yǎng)。

　　2. 2 毛狀根誘導

　　用無菌手術刀在三葉青無菌苗葉片表面劃出傷口，接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基(PCM)預培養(yǎng)3天。期間，將-80 ℃保存的發(fā)根農桿菌ATCC15834和C58C1解凍后，取50 μL加入50 mL YEB液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)(28 ℃，220 r·min-1)16～18 h，OD600=0.4～

　　0.6。離心(4 ℃，5500 r·min-1，5 min)，棄上清;用50 mL ILD懸浮菌體，搖床培養(yǎng)(25.5 ℃，150 r·min-1)1～1.5 h后，浸染預培養(yǎng)的三葉青葉片。室溫下，將預培養(yǎng)的三葉青葉片放入含有ATCC15834和C58C1菌的ILD浸染液中，浸染5 min。用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，轉入CID培養(yǎng)基(培養(yǎng)基表面加一層無菌濾紙，用ILD潤濕濾紙表面)，共培養(yǎng)3天。然后，用無菌濾紙吸干葉片表面菌液，接入除菌培養(yǎng)基DM中培養(yǎng)7天，再將葉片轉入SM培養(yǎng)基中除菌7～10天。不定根長度達0.5～2 cm時，將其切下，接種到SCD1培養(yǎng)基，每15天更換1次繼代培養(yǎng)基。繼代2次后，將毛狀根接種到SCD2培養(yǎng)基，15天更換1次培養(yǎng)基。

　　2. 3 毛狀根rol C基因的PCR檢測

　　按照植物DNA提取試劑盒(天根，北京)的方法提取三葉青毛狀根、無菌苗葉片的DNA。吸取菌液500 μL置于1.5 mL離心管，12 000 r·min-1離心2 min，去清液，加TE液100 μL(TE：10 mmo·L-1 Tris-HCl，1 mmo·L-1 EDTA，pH 8.0)，重懸菌體，沸水煮5 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清于新離心管中，作為PCR檢測中的陽性對照。