材料與方法

1.材料：MCF-7細(xì)胞由本實驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21及質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO生物公司；胎牛血清為杭州江濱公司產(chǎn)品；ImPro-II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自NEB公司；谷胱甘肽瓊脂糖珠4B購自AmershamPharmaciaBiotechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的GST抗體、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP購自Sigma公司；引物合成和測序由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

2.MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA提取：用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。收集MCF-7細(xì)胞，計數(shù)，在約5×106細(xì)胞中加入350μLRLT裂解液，充分混勻后加入等體積的70%乙醇，混勻并轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，8000r/min離心15s，棄上清液；加入700μLRW1液，8000r/min離心15s，棄上清液；加入500μLRPE液，8000r/min離心15s，棄上清液，重復(fù)1次；將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個新的2mL的離心管中，最大轉(zhuǎn)速離心1min后加入30~50μL不含RNase的水，最大轉(zhuǎn)速離心1min后，將RNA洗脫至1.5mL的EP管中。

3.RT-PCR擴(kuò)增cdc25c基因：采用ImPro-II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取1μgRNA為模板，以oligo（dT）15和隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)條件：25℃5min，42℃1h）。70℃、15min滅活反應(yīng)體系中的逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑。以該cDNA為模板，以正向特異性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'（含BamHⅠ酶切位點）、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3（'含XhoⅠ酶切位點）擴(kuò)增cdc25c基因序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及載體pGEX-4T-1分別用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，篩選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定。

4.GST-Cdc25C蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將pGEX-GST-Cdc25C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，接種至氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至D600nm為0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，12℃、200r/min培養(yǎng)6~8h，收獲菌體，超聲波低溫破碎菌體，離心后取上清，加入4×SDS上樣緩沖液［200mmol/LTris-HCl（pH6.8），8%SDS，4%溴酚藍(lán)，40%甘油、10%β-巰基乙醇］，沸水浴5min，將樣品進(jìn)行SDS-PAGE。

5.GST-Cdc25C蛋白的純化：在菌體上清中加入谷胱甘肽（GSH）瓊脂糖珠4B，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h，1000r/min離心，棄上清，用PBS緩沖液洗3次，備用；分別向結(jié)合GST的GSH瓊脂糖珠、與GST-Cdc25C結(jié)合的GSH瓊脂糖珠中加入1×SDS上樣緩沖液［50mmol/LTris-HCl（pH6.8），2%SDS，1%溴酚藍(lán)，10%甘油、2.5%β-巰基乙醇］，沸水浴5min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

6.免疫印跡分析：SDS-PAGE結(jié)束后，將膠用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1h，加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的GST抗體，室溫孵育1h，用PBST洗膜3次，每次5min，最后將含有辣根過氧化物酶底物的ECL滴加到膜上，在暗室中進(jìn)行X線膠片顯影。

7.磷酸酶活性分析：在300μL磷酸酶反應(yīng)緩沖液［50mmol/LTris-HCl（pH8.0），50mmol/LNaCl，1.0mmol/LEDTA，5mmol/LDTT，0.1%BSA］中分別加入1μg純化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白，隨后加入Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP（終濃度150μmol/L），37℃溫育，用熒光分光分度計在490nm激發(fā)光波長、530nm發(fā)射光波長處檢測反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度，熒光強度值的增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。

結(jié)果

GST-Cdc25C融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：為了獲得cdc25c基因，我們首先提取了MCF-7細(xì)胞總RNA，用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄獲得MCF-7cDNA庫，并用cdc25c特異性引物從cDNA庫中擴(kuò)增獲得cdc25c基因，PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果見圖1。測序結(jié)果表明，該PCR產(chǎn)物序列與cdc25c基因序列（GenBankNo.BC019089）一致。隨后，通過BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點將cdc25c基因的PCR產(chǎn)物克隆至pGEX-4T-1載體上，GST-Cdc25C融合表達(dá)陽性克隆雙酶切鑒定結(jié)果如圖1所示。

GST-Cdc25C融合蛋白的表達(dá)及純化：用大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)GST-Cdc25C融合蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)條件為低溫12℃、6~8h。收集菌體，于15mL冰浴的PBST（含蛋白酶抑制劑1片/25mL）中超聲波破碎4min，使可溶性GST-Cdc25C融合蛋白釋放到上清液中。SDS-PAGE結(jié)果表明，與GST對照組相比，在相對分子質(zhì)量約87×103位置出現(xiàn)了顯著條帶（圖2A），與GST-Cdc25C蛋白的相對分子質(zhì)量一致，說明GST-Cdc25C在大腸桿菌BL21中獲得了可溶性表達(dá)。隨后，用GSH瓊脂糖珠與裂解上清混勻，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h，離心得到純化的相對分子質(zhì)量為87×103的GST-Cdc25C融合蛋白，并存在一定程度的降解。免疫印跡實驗進(jìn)一步表明，GST-Cdc25C融合蛋白及GST對照蛋白均獲得表達(dá)及純化（圖2B）。

GST-Cdc25C的磷酸酶活性分析：以3-OMFP為Cdc25C磷酸酶反應(yīng)底物，在磷酸酶活性反應(yīng)體系中分別加入1μgGST和GST-Cdc25C融合表達(dá)蛋白，37℃溫育，每隔5min用熒光分光分度計檢測反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度，熒光強度增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用熒光強度值相對時間變化繪圖，結(jié)果如圖3，與GST蛋白相比，加入GST-Cdc25C融合蛋白的反應(yīng)體系的熒光值顯著升高且速率穩(wěn)定（基本呈線性），說明原核表達(dá)的GST-Cdc25C具有顯著的穩(wěn)定的磷酸酶活性。

討論

在成功釣取人源cdc25c全長基因的基礎(chǔ)上，我們表達(dá)純化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白。由于GST-Cdc25C在表達(dá)過程中容易形成天然二硫鍵，易導(dǎo)致包涵體的形成，且結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定增加，因此存在一定程度的降解。Cdc25C在調(diào)控細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換過程中有重要作用，其磷酸酶活性對于激活Cdc2/周期蛋白B復(fù)合體，開啟細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程至關(guān)重要。目前發(fā)現(xiàn)的Cdc25C上游調(diào)節(jié)分子主要通過相互作用及磷酸化或泛素化修飾調(diào)節(jié)Cdc25C的磷酸酶活性及亞細(xì)胞定位，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。本研究中，我們表達(dá)純化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白，為研究c-Abl酪氨酸激酶通過Cdc25C調(diào)控G2/M轉(zhuǎn)換的分子機理提供了基礎(chǔ)。（本文圖略）

本文作者：張鵬 劉萱 曹誠 單位：北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所