太平洋牡蠣在活品流通過程中的質譜-肽組學分析

　　摘 要 在實驗室模擬太平洋牡蠣保活流通過程，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術(UHPLC-Q-TOF)分析太平洋牡蠣在活品流通過程中內源肽的變化，利用化學計量學方法篩選出各流通階段的多肽標志物，以期篩選出一組評價太平洋牡蠣活品流通過程中品質變化的新指標。根據肽組學技術對整個活品流通階段的3個環節(清洗、暫養凈化以及無水保活)共7個關鍵時間點的樣品進行內源肽提取，使用UHPLC-Q-TOF分離鑒定，并獲得各個流通階段的肽組輪廓。通過主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等多元統計分析進行數據挖掘，并篩選出潛在的多肽標志物，經過在線數據庫比對，鑒定出多肽氨基酸序列。結果表明，在清洗、暫養凈化以及無水保活階段分別篩選出3、10、8條潛在的多肽標志物。以潛在的多肽標志物DYDPVDK為例，建立可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質譜多反應監測(MRM)的分析方法。本研究采用肽組學技術對活品太平洋牡蠣在不同流通階段的內源肽進行組學表征，篩選出指征不同流通階段的潛在的多肽標志物，為活品貝類的流通過程提供檢測依據。

　　關鍵詞 超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜; 太平洋牡蠣; 肽組學; 多反應監測; 活品流通; 化學計量學

　　《分析試驗室》(月刊)1982年創刊，是國內外公開發行的綜合性分析化學刊物。《分析試驗室》是理論與實踐、學術與應用并蓄的專業期刊。

　　1 引 言

　　牡蠣屬軟體動物門，瓣鰓綱，牡蠣目，牡蠣科，是一種重要的海洋水產資源，其營養豐富，肉質鮮嫩，深受消費者的喜愛。隨著世界上貝類海產品的產品結構發生變化，國內外市場上特別是一些內陸地區對鮮活貝類需求也越來越高。因此，需要建立與優化活品牡蠣的生鮮供應鏈[1～3]，完善活品牡蠣供應鏈的前提是建立精準的、針對活品牡蠣的品質評價方法。

　　隨著捕撈后流通時間的延長，活品牡蠣的體內會發生一系列變化，導致品質不斷下降直至死亡。在流通過程中因缺少攝食而需要消耗自身能量物質維持生命活動，造成脂肪、蛋白、糖原等能量物質的下降，以及活力水平(超氧化物歧化酶、ATP等)、風味及營養品質下降。牡蠣活品在流通過程中面臨多種環境脅迫，包括饑餓、干露和溫度脅迫等，造成流通過程中其品質變化的復雜性。目前，對活品牡蠣在流通過程中的品質評價主要依靠傳統的風味指標、能量代謝產物以及生命特征等[1，3]，尚未有國家標準，難以全面反映牡蠣的整體品質[4]。因此，需要不斷完善品質評價體系。

　　隨著檢測技術與分析技術的進步，尤其是高分辨質譜(High resolution mass spectrometry，HRMS)[5]技術的成熟和相關數據處理軟件的升級，組學技術已成為品質評價的重要技術[6～9]。近年提出的食品組學技術[10] ，不僅可以解決食品基質復雜的難題[11]，更能從整體生物學角度分析品質[9]。肽組學是一個來源于蛋白質組學的新興領域[12]，研究生物樣本中的所有內源性多肽，可縮小蛋白組與代謝組的差距[13] 。肽組學與蛋白質組學的技術方法體系有許多相似之處，但在分析內容如研究對象、解析深度等方面也存在顯著差異。總體而言，在以質譜技術為基礎的組學分析中，肽的分析難度小于完整蛋白，因此，肽作為分析目標與蛋白相比更具吸引力。目前，蛋白組被廣泛應用于水產品品質變化的檢測，如Bosworth等[14]對受低氧脅迫的斑馬魚的魚肉進行研究分析，發現低氧對6種低豐度蛋白產生影響，而不影響蛋白的表達模式，而肽組學技術則多被應用于食源性活性肽結構的鑒定，如Wu等[15]利用肽組學中的LC-MS/MS并輔以定量構效關系對大豆蛋白源ACE抑制肽進行了純化和表征，闡明5條三肽序列分別為IVF、LLF、LNF、LSW和 LEF; 肽組學也被用于人類疾病標志物的篩查[12，16]。但在活品牡蠣流通過程中內源肽是否發生變化以及結構鑒定方面尚未見報道。

　　本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF)技術，結合化學計量學方法，分析篩選出各流通階段活品太平洋牡蠣潛在的多肽標志物，并建立了可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質譜多反應監測(MRM)的分析方法。本研究利用肽組學技術闡明太平洋牡蠣在流通階段內源肽的變化規律，并篩選出太平洋牡蠣在活品流通過程中與品質變化有關的多肽標志物，以期建立一組分子水平上的評價指標，完善活品牡蠣的品質評價體系。

　　2 實驗部分

　　2.1 儀器與試劑

　　Nexera X2 30A高效液相色譜儀(日本島津公司); 1290高效液相色譜(美國Agilent 公司); AB SCIEX Triple TOF 5600質譜儀、Triple QuadTM 5500三重四極桿質譜儀(美國SCIEX 公司); MQS50001型超純水系統(美國Millipore公司)。

　　甲酸(質譜級)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA) (美國Sigma公司); 乙腈(美國Fisher公司); 其它試劑均為分析純。

　　2.2 實驗方法

　　2.2.1 樣品的采集 活品太平洋牡蠣選用山東乳山(36°49′38.66′′ N，121°42′3.84′′E)的2 齡貝[殼高(108.32± 2.5 )mm，體質量(76.23±3.5)g]，確保每組實驗樣品大小均一，采捕于2018年4月。太平洋牡蠣捕撈到岸后，加冰運至實驗室，立刻取出30只牡蠣作為起始點(編號為a組)，并對牡蠣進行常規清洗，再次取樣(編號為b組)。清洗后，對太平洋牡蠣進行暫養凈化處理24 h，進行真空包裝，于4℃進行保活實驗(1～9 d)，于第1、3、5、7和9 d進行取樣。

　　2.2.2 多肽樣品制備 按上述采樣時間準時采樣，隨機采取30只牡蠣，迅速取可食部位并用液氮速凍后研磨。取20 g研磨后的粉末，95℃加熱滅酶10 min，在4℃以15000 r/min離心15 min，收集上清液，得肽粗提液。