響應面結合遺傳算法優化鷹嘴豆中抗炎活性成分的提取

　　摘要：以異黃酮提取率為評價指標，考察超聲時間、乙醇濃度和料液比對鷹嘴豆異黃酮提取率的影響，在單因素實驗基礎上，利用響應面結合遺傳算法優化鷹嘴豆異黃酮提取工藝，得到最佳提取工藝條件為：提取時間為 1.73 h、乙醇濃度為 78.64%和料液比 1:24.9 g/mL，鷹嘴豆中異黃酮提取率為 0.76 mg/g。以 5-脂氧合酶為作用靶點，利用超濾-質譜技術(UF-MS)篩選鷹嘴豆中具有抑制 5-脂氧合酶作用的潛在抗炎活性成分。結果表明，利用響應面結合遺傳算法可以進一步優化提高鷹嘴豆中活性成分的提取率;鷹嘴豆中具有潛在的抗炎活性成分為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素 A，其結合強度分別為 40.82%、36.93%、31.65%、28.75%和 22.51%。

　　關鍵詞：鷹嘴豆(Cicer arietinum L.);響應面(RSM);遺傳算法(GA);超濾-質譜(UF-MS); 5-脂氧合酶(5-LOX)

　　牛華周; 康賀磊; 侯萬超; 劉春明; 李賽男; 張語遲; 劉震 中國糧油學報 2021-12-31

　　鷹嘴豆(Cicer arietinum L.)又名雞豆和桃豆等，是豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子，在我國多個省份均有種植[1]，具有補中益氣、溫腎壯陽、主消渴之功效[2]。近年來，國內外對鷹嘴豆的生物活性研究多有報道，鷹嘴豆中所含的異黃酮類成分具有抗氧化和抑制 Caco-2 細胞生長等作用[3]，但是對于鷹嘴豆中抗炎活性的研究報道很少。而 5-脂氧合酶對于炎癥的發生存在著密不可分的關系[4]，因此利用 5-脂氧合酶對鷹嘴豆中抗炎活性成分進行初步研究，為從鷹嘴豆中分離抗炎活性成分提供一定的參考。鷹嘴豆異黃酮提取工藝參數的優化是非線性的擬合過程，因此利用遺傳算法較為合適。遺傳算法是一種模擬自然進化過程的全局尋優算法[5]，在優化天然產物有效成分的提取條件中有著廣泛應用[6]。本實驗利用響應面對鷹嘴豆異黃酮提取過程中的超聲時間、乙醇濃度和料液比 3 個因素進行模擬推算，將響應面優化所得的擬合函數作為遺傳算法的適應性函數，在程序中進行個體評價、選擇運算、交叉運算以及變異運算。運行遺傳算法優化利用 Matlab 2018b 程序和程序附帶的 GAOT 工具箱完成[7]。實驗以鷹嘴豆為研究對象，首先從單因素水平考察了提取條件對提取率的影響;其次，應用響應面結合遺傳算法優化鷹嘴豆異黃酮的提取方法;利用超濾-質譜技術對鷹嘴豆粗提中的化學成分進行抗炎活性成分篩選。應用液-質聯用技術對鷹嘴豆中抗炎活性成分進行初步鑒定。

　　1 材料與儀器

　　1.1 材料與儀器

　　鷹嘴豆，豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子。5-脂氧合酶;乙腈(色譜級);超濾離心管(100 ku)。 Waters 2695 高效液相色譜儀，LCQ-Fleet 超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀，DK-98-Ⅱ 恒溫水浴鍋，KQ-400DE 型超聲波清洗器。

　　1.2 方法 1.2.1 超聲輔助提取工藝的優化 1.2.1.1 蘆丁標準品標準曲線的繪制

　　取 5.12 mg 蘆丁標準品用 65%乙醇溶液溶解、定容于 25.0 mL 容量瓶中備用。分別取 1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mL 蘆丁標準品溶液，按照文獻[8]方法分別加入顯色劑，顯色 10 min，采用紫外-可見分光光度計在 510 nm 測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，制作鷹嘴豆異黃酮濃度吸光度標準曲線。

　　1.2.1.2 鷹嘴豆的提取

　　鷹嘴豆粉碎后過 100 目篩，按料液比加入乙醇溶液，超聲提取，過濾后蒸干，用 65% 乙醇溶解，顯色，測定鷹嘴豆異黃酮含量。

　　1.2.1.3 單因素實驗

　　準確稱取粉碎后的鷹嘴豆 5.0 g，采用超聲法提取鷹嘴豆異黃酮，分別考察了超聲時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇濃度(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、 85.0%、95.0%)和料液比(1：10.0、1：15.0、1：20.0、1：25.0、1：30.0、1：35.0、1： 40.0 g/mL)對鷹嘴豆異黃酮提取率的影響。

　　1.2.1.4 響應面實驗

　　依據單因素實驗結果，選取超聲時間(X1)、乙醇濃度(X2)和料液比(X3)為實驗因素，以異黃酮得率(Y)為響應值，利用 Design-Expert 中的 Box-Behnken 組合，進行 3 因素 3 水平的響應面實驗，實驗因素與水平設計如表 1 所示。 式中：Xi 和 Xj為自變量，b0、bi、bii 和 bij分別為截距、線性回歸、二次項的回歸、各交互項的回歸的系數[9]。

　　1.2.1.5 遺傳算法設計優化

　　在 MATLAB 程序中，利用神經網絡工具箱對數據進行神經網絡建模。實驗創建的提取因素優化模型為 3 層 ANN 模型(輸入層、隱含層和輸出層)，輸入層作為自變量;輸出層給出因變量[10]。選擇超聲時間、乙醇濃度和料液比為自變量，鷹嘴豆異黃酮提取率為因變量，選擇輸入層三個神經元，輸出層一個神經元的網絡模型。經過多次訓練實驗，得到了最佳的神經網絡模型。采用優化得到的擬合函數，利用遺傳算法對輸入變量(超聲時間、乙醇濃度和料液比)進行優化，以使鷹嘴豆異黃酮提取率最大為目標。設置遺傳算法的搜索范圍大小為-1～1，優化得出全局優化解[11]。

　　1.2.2 超濾-質譜法篩選鷹嘴豆提取物中 5-脂氧合酶抑制劑

　　200.0 μL 的反應體系分別由 100.0 μL Tris-HCl 緩沖溶液、20.0 μL 300 mg/mL 樣品溶液與 80.0 μL 不同濃度的 5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0 和 10 U/mL，pH 7.2~7.4)組成，將反應體系渦旋震蕩，混勻后 37℃水浴孵育 30 min，利用超濾膜(100 ku)分離與酶結合的復合物和未結合的小分子，分離時采用離心機在 13000 r/min 的條件下離心 10 min。加入 100.0 μL Tris-HCl 緩沖溶液沖洗超濾膜，沖洗未結合的小分子化合物，離心 10 min，重復該操作 3 次。再加入 100.0 μL 50%甲醇水(50：50)溶液，釋放與 5-脂氧合酶結合的活性小分子，離心 10 min，重復步驟 3 次。將甲醇洗脫液合并，分析測定各活性成分的含量。空白對照組由緩沖溶液代替酶溶液，其他條件不變，重復實驗 3 次。活性成分與酶的結合能力以增強因子表示，計算公式為：

　　式中：A1 為與 5-脂氧合酶結合的活性小分子化合物的量，A2 為未與 5-脂氧合酶結合的小分子化合物初始的量[12]。

　　1.2.3 高效液相色譜以及質譜檢測條件

　　色譜柱為 SunFireTM C18 色譜柱(4.6 mm × 250 mm，I.D.5.0 μm，Waters)，檢測器：Waters 2998 二極管陣列檢測器，流動相：水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度：0~10 min，3%~3% B; 10~40 min，3%~65% B;40~60 min，65%~100% B，檢測波長：254 nm，進樣量：10.0 μL。利用六通閥聯接質譜與液相色譜二極管陣列檢測器(DAD)，選擇大氣壓化學電離離子源(APCI)為質譜離子源，掃描范圍為 150~400 0;采用正離子分析模式;離子阱壓力為 3.10 × 107 Pa;鞘氣輔助氣為高純度 N2。液相色譜參數同上述高效液相色譜參數。

　　1.2.4 數據統計與分析

　　每組實驗重復 3 次，結果用“平均值±標準差”表示;采用 Design-Expert 軟件中 Box- Behnken 組合對實驗數據進行方差分析(ANOVA);采用 Matlab 軟件優化超聲提取鷹嘴豆中異黃酮工藝參數;Design-Expert8.0.6 軟件設計組合實驗以及繪制響應面圖形，利用 Origin 進行單因素試驗繪圖。

　　2 結果分析

　　2.1 單因素試驗結果

　　超聲提取鷹嘴豆異黃酮的單因素實驗，結果如圖 2 所示。超聲時間在 0~1.5 h 內鷹嘴豆異黃酮提取率逐漸增加，超時時間大于 1.5 h 后提取率逐漸降低。提取時間為 1.5 h 時，鷹嘴豆異黃酮提取率達到最大值。由于超聲破壞了鷹嘴豆的細胞壁和細胞膜，導致鷹嘴豆細胞內異黃酮大量溶出，因此超聲時間越長，異黃酮的溶出率越高，隨提取時間的繼續增加，鷹嘴豆細胞組織中大量細胞破裂，其他雜質的溶出，影響鷹嘴豆異黃酮的溶出率[13]，因此最佳超聲時間為1.5h。

　　鷹嘴豆異黃酮的提取率在乙醇濃度為 30%~70%時，隨著乙醇濃度的增加逐漸升高，當乙醇濃度大于 80%時，提取率逐漸降低。該現象可能由于乙醇濃度增加，異黃酮的溶解度逐漸降低引起的。異黃酮一般易溶于高濃度有機溶劑，但異黃酮苷一般易溶于低濃度乙醇等有機溶劑。異黃酮苷在超聲提取條件下不易分解，因此在乙醇濃度為 35%~75%時，提取率逐漸增加，當乙醇濃度繼續增加時，將不利于鷹嘴豆中大量的異黃酮苷的溶出，因此提取率會降低[14]，因此最佳乙醇濃度的為 75%。

　　鷹嘴豆異黃酮提取率在料液比 1：10.0 至 1：25.0g/mL 之間呈現逐漸增加的趨勢，是因為隨著料液比的增加，鷹嘴豆和溶劑之間的濃度差增加，加速異黃酮的溶出。當料液比大于 1：25.0 時，乙醇體積過多時也可能造成其他物質的滲出，影響異黃酮的溶出[15]。因此最佳料液比為 1：25.0 g/mL。

　　2.2 響應面分析實驗結果

　　鷹嘴豆異黃酮的提取條件選取超聲時間、乙醇濃度和料液比三個因素，根據 Box-Behnken 實驗原理，利用 Design-Expert 程序，設計三因素三水平的響應面實驗，見圖 3。利用響應面優化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件，并擬合出相應的函數，結合神經網絡進行進一步優化。利用響應面擬合得到的函數為： 2 2 2 Y A B C AB BC A B C ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.74 0.04 0.05 0.02 0.04 0.03 0.06 0.10 0.14 (3)所選用的二次多項模型 P < 0.05，R 2=0.92，說明該模型二次方程顯著，本方法可靠，對模擬分析三因素三水平實驗條件是可行的。并且 f>0.05 為模型項顯著。

　　2.3 遺傳算法優化實驗結果

　　利用 Matlab R2018b 軟件中的遺傳算法優化工具箱，在響應面所構建的擬合函數的基礎上，以鷹嘴豆異黃酮提取率為遺傳算法的適應度函數。經過 N 迭代后，適應度函數值趨向適應度最高的個體[16]，即鷹嘴豆異黃酮提取率的最大值。由圖 4 可見，當迭代 13 次時，群體的適應性函數變化趨勢達到最大值 0.76，即鷹嘴豆異黃酮提取率最大值為 0.76 mg/g，此時超聲時間(X1)、乙醇濃度(X2)、和料液比(X3)水平編碼分別為 0.47、0.36 和-0.02，即實驗水平分別為 1.73 h、78.64%和 1:24.9 g/mL。在此條件下，提取鷹嘴豆中異黃酮的成分，所得異黃酮含量理論值為 0.76 mg/g，遺傳算法優化結果如圖 4 所示。響應面與遺傳算法相結合對鷹嘴豆最佳提取工藝進行優化，能較準確地優化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件。

　　2.4 超濾-質譜技術篩選鷹嘴豆 5-脂氧合酶抑制劑

　　鷹嘴豆超濾實驗的空白對照組以及分別與 80.0 μL 不同濃度的 5-脂氧合酶(0.5、1.0 和 10.0 U/mL)結合的實驗組 HPLC 圖見圖 5。鷹嘴豆提取物中有 5 個成分可以與 0.5、1.0 和 10.0 U/mL 的 5-脂氧合酶結合，對 5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潛在的抗炎活性[17]。各活性成分與酶的結合強度用結合因子為，考察 5 個化合物與 5-脂氧合酶的結合能力。由表 2 可知：5 個活性成分對濃度為 1.0 U/mL 的 5-脂氧合酶活性抑制效果顯著，其中化合物 5 的結合強度最高，其次為化合物 2、化合物 3、化合物 4 和化合物 1。通過超濾-質譜技術研究鷹嘴豆與 5-脂氧合酶的抑制作用，操作簡便，超濾-質譜技術具有高通量檢測的優勢，是一種快速高效的初步篩選復雜提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作簡單等優勢。

　　2.5 液-質聯用技術初步鑒定鷹嘴豆中化學成分

　　利用液-質聯用技術對鷹嘴豆提取物中的化學成分進行初步的分離與鑒定，通過質譜信息與標準品比對，分析鷹嘴豆中的化學成分的信息，結果如表 3。利用液-質聯用技術對鷹嘴豆提取物中活性成分進行初步鑒定和解析，根據各化合物的保留時間、分子離子以及碎片離子等信息，鑒定 5 個具有抑制 5-脂氧合酶活性的異黃酮類化合物分別為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素 A [19-22]。

　　3 結論

　　利用遺傳算法結合響應面優化鷹嘴豆中異黃酮的提取工藝，優化得到最佳提取工藝為：提取時間為 1.73 h、乙醇濃度為 78.64%和料液比 1:24.90 g/mL，在此條件下，鷹嘴豆中異黃酮提取率為 0.76 mg/g。利用超濾質譜法篩選出鷹嘴豆中 5 個具有抑制 5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度為 1.0 U/mL 時，抑制酶的活性效果顯著，鷹嘴豆芽素 A 與 5-脂氧合酶結合度最高，為天然抗炎藥物的開發與利用提供了參考。