27種植物提取物抗煙草花葉病毒活性分析

　　摘要：以煙草花葉病毒(TMV)為模式病毒，采用半葉枯斑法及葉圓片法，對(duì)27種植物提取物的抗TMV活性進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：在濃度為1mg/mL時(shí)12種植物提取物對(duì)TMV有治療作用，其中藿香薊對(duì)TMV的治療作用最顯著，抑制率為53.06%，與陽(yáng)性對(duì)照藥劑寧南霉素(57.33%)相比無(wú)顯著差異。8種植物提取物對(duì)TMV侵染具有保護(hù)效應(yīng)，其中馬桑的保護(hù)活性最高，抑制率達(dá)53.64%;其次為銀膠菊和黑蒿，抑制率分別為46.51%和36.63%。9種植物提取物對(duì)TMV有體外鈍化作用，其中革命菜、蕁麻和藿香薊3種植物提取物的鈍化活性較強(qiáng)，抑制率分別是62.20%、54.92%和51.75%。22種植物提取物對(duì)TMV增殖有抑制活性，且活性高于或相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素處理組，其中水麻、香絲草處理組的病毒含量相當(dāng)于健康煙葉，表明其能完全抑制TMV增殖。

　　本文源自西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2020,40(05):93-99.《西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》是由西南林業(yè)大學(xué)主辦的林業(yè)類(lèi)綜合性學(xué)術(shù)期刊，主要刊登森林生物學(xué)、林木遺傳育種、森林培育、森林保護(hù)、森林經(jīng)理、野生動(dòng)植物保護(hù)與利用、園林植物與風(fēng)景園林、水土保持與荒漠化防治、木材科學(xué)與技術(shù)及林產(chǎn)化學(xué)等方面具有創(chuàng)新性的原始科研成果。讀者對(duì)象為國(guó)內(nèi)外農(nóng)林科技工作者及高等院校師生。該刊1981年創(chuàng)刊，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行，面向全國(guó)組稿。

　　病毒是僅次于真菌的第二大作物病害，素有“植物癌癥”之稱(chēng)[1]。煙草花葉病毒(TMV)侵染的寄主范圍很廣，可侵染茄科、十字花科、菊科等36科400多種植物[2]。由TMV引發(fā)的煙草花葉病毒病是煙草的主要病害，造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降，且TMV性質(zhì)穩(wěn)定在環(huán)境中極易通過(guò)植物和機(jī)械工具傳播，給煙草產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。我國(guó)南方煙草種植地區(qū)，煙草早期發(fā)病造成的損失可達(dá)50%～70%[3,4]。通過(guò)化學(xué)藥劑防治煙草花葉病毒病是現(xiàn)在主要的防治措施，但大量使用化學(xué)藥劑會(huì)使煙草花葉病毒產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)能徹底防控TMV的生物藥劑，因此篩選并開(kāi)發(fā)高效、低毒的植物病毒抑制劑十分迫切。

　　全世界有1/3的藥物均是從植物中開(kāi)發(fā)而來(lái)。植物中含有豐富的次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物形成的病毒抑制劑作用方式獨(dú)特，具有良好的環(huán)境兼容性。研究抗病毒藥劑的一個(gè)重要來(lái)源是從植物提取物中篩選活性物質(zhì)[5]。許多藥物研發(fā)項(xiàng)目中，天然產(chǎn)物是重要且可行的先導(dǎo)化合物來(lái)源[6]。我國(guó)植物資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)多種植物提取物具良好的抗TMV活性[7,8,9]。從植物中尋找抗TMV活性物質(zhì)是開(kāi)發(fā)抗病毒藥劑的一個(gè)重要來(lái)源。本研究對(duì)27種植物提取物進(jìn)行初步抗TMV活性篩選，為開(kāi)發(fā)新型抗病毒制劑提供依據(jù)。

　　1、材料及方法

　　1.1試驗(yàn)材料

　　1.1.1供試植物

　　27種植物材料于2018年5—8月采自云南昆明、廣西賓陽(yáng)、遼寧喀左等地，具體信息見(jiàn)表1。

　　表1供試植物名錄

　　1.1.2供試病毒

　　由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供的煙草花葉病毒普通株系U1。繁殖于普通煙K326上，采用魏遠(yuǎn)方[10]的方法進(jìn)行煙草花葉病毒提純，濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定為16mg/mL，置于-80℃冰箱中保存，備用。

　　1.1.3供試寄主

　　TMV局部侵染寄主心葉煙、TMV系統(tǒng)侵染寄主普通煙K326，漂盤(pán)育苗，移栽于無(wú)蟲(chóng)溫室中培育，待煙苗長(zhǎng)至4～6片真葉時(shí)進(jìn)行活性測(cè)定。

　　1.2試驗(yàn)方法

　　1.2.1植物提取物的制備

　　植物材料風(fēng)干粉碎，稱(chēng)取200g樣品，乙醇回流提取3次，每次4h，合并并濃縮3次提取液，得乙醇提取物，二甲基亞砜(DMSO)溶解稱(chēng)取的一定提取物，配成100mg/mL母液，置于4℃冰箱備用，臨時(shí)用蒸餾水稀釋置1mg/mL。

　　1.2.2抗TMV活性測(cè)定

　　采用活體半葉枯斑法測(cè)定提取物對(duì)TMV侵染的抑制活性[11]。挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的4～6葉齡心葉煙，每株挑選中上部大小相似3個(gè)葉片，采用3種施藥方式：1)先施藥，將提取物噴灑在煙葉片上，6h后用金剛砂摩擦接種病毒，以測(cè)定各提取物對(duì)感染TMV煙葉的保護(hù)作用;2)混合施藥，將不同提取物與病毒混合30min后用金剛砂接種病毒，測(cè)定提取物對(duì)TMV的體外鈍化作用;3)后施藥，用金剛砂接種病毒6h后在煙葉上噴施各稀釋后的提取物，以測(cè)定不同提取物對(duì)TMV的治療作用;左半葉噴施1mg/mL供試提取物作為試驗(yàn)組，右半葉噴相同濃度的DMSO溶液作為對(duì)照組，將煙苗放在無(wú)蟲(chóng)溫室中培養(yǎng)，3～4d后待枯斑癥狀明顯時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，按以下公式計(jì)算抑制率。

　　采用葉圓片法測(cè)定提取物對(duì)TMV增殖抑制活性[12]。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的健康普通煙，噴施1mg/mL提取物作為處理;噴施相同濃度的DMSO溶液作為對(duì)照;以800倍液寧南霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥。施藥24h后每株煙挑選一片中上部葉片摩擦接種TMV，接種TMV后48h打直徑為1cm的圓片，每片葉片取10個(gè)圓片于離心管，保存在-70℃冰箱，每個(gè)處理重復(fù)3次，以間接ELISA法檢測(cè)病毒含量。以噴施1mg/mLDMSO溶液，不接種TMV的煙苗作為健康對(duì)照[13]。

　　2、結(jié)果與分析

　　2.1提取物對(duì)煙草花葉病毒的抑制活性

　　先施藥結(jié)果(表2)表明，馬桑提取物對(duì)TMV的抑制活性最強(qiáng)(圖1a)，抑制率為53.64%，與陽(yáng)性對(duì)照藥寧南霉素間無(wú)顯著差異;其次為銀膠菊，抑制率為46.51%;再次為黑蒿，抑制率為36.63%;銀膠菊與馬桑的活性差異不顯著，但顯著高于黑蒿、紫紅獐芽菜、大薊、小花鬼針草、忍冬、革命菜6種提取物的抑制率，對(duì)TMV侵染有一定保護(hù)作用。紫紅獐牙菜、大薊、小花鬼針草、忍冬、革命菜5種植物提取物對(duì)TMV侵染煙草也有一定的保護(hù)作用，抑制率介于10%～30%。其余19種植物提取物未顯示出保護(hù)活性。

　　表28種植物提取物對(duì)TMV的保護(hù)作用

　　注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)取平均值，提取物濃度為1mg/mL，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

　　施藥結(jié)果表明(表3),12種植物提取物對(duì)TMV侵染有治療作用，其中藿香薊提取物的治療效果(圖1b)最強(qiáng)抑制率為53.06%，與陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素的抑制率56.84%差異不顯著;此外天名精、青蒿、全葉馬蘭、馬桑4種提取物的治療活性也較好，抑制率介于40%～45%;紫紅獐牙菜、絡(luò)石、革命菜、角蒿、蕁麻、銀膠菊、牛尾蒿7種植物提取物對(duì)煙草花葉病毒也有一定治療作用，抑制率介于10%～40%;其余15種植物提取物對(duì)TMV無(wú)治療活性。

　　表312種植物提取物對(duì)TMV治療作用

　　2.2提取物對(duì)煙草花葉病毒的鈍化活性

　　混合施藥結(jié)果表明(表4),9種植物提取物對(duì)TMV有不同程度的鈍化活性，其中革命菜(圖1c)、蕁麻鈍化活性顯著，抑制率分別為62.20%和54.92%，與陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素?zé)o顯著差異;藿香薊和角蒿的抑制率分別為51.75%和40.81%，與革命菜、蕁麻的鈍化活性差異不顯著，但顯著低于寧南霉素;角蒿提取物對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用抑制率為40.81%，次于上述3種植物提取物;魚(yú)眼草、牛尾蒿、土木香、馬桑、女萎5種植物提取物對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用介于10%～40%;剩下的18種植物提取物均對(duì)煙草花葉病毒無(wú)體外鈍化活性。

　　圖1活體半葉枯斑法試驗(yàn)結(jié)果

　　a.馬桑保護(hù)作用b.藿香薊治療作用c.革命菜鈍化作用左半葉為處理，右半葉為對(duì)照。

　　表49種提取物對(duì)TMV的鈍化作用

　　2.3提取物對(duì)煙草花葉病毒的增殖活性

　　病毒衣殼蛋白(CP)是病毒在寄主體內(nèi)移動(dòng)的標(biāo)記，病毒在寄主體內(nèi)的增殖可以通過(guò)病毒衣殼蛋白在寄主體內(nèi)的積累量來(lái)表現(xiàn)[12]。本研究采用普通煙葉圓片法結(jié)合間接ELISA法檢測(cè)了經(jīng)27種植物提取物處理后普通煙葉圓片中煙草花葉病毒蛋白衣殼的累積情況，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照相比除大薊、小花鬼針草、金腰箭、香青蘭、馬桑5種提取物外，其余22種提取物對(duì)TMV增殖均有一定的抑制活性。其中革命菜、藿香薊、絡(luò)石、老鸛草、角蒿5種提取物與寧南霉素?zé)o顯著差異，表明這些提取物抑制TMV增殖的活性相當(dāng)于陽(yáng)性藥劑寧南霉素;牛尾蒿、土木香、千里光、魚(yú)眼草、天名精、黑蒿、茵陳蒿、全葉馬蘭、銀膠菊、青蒿、細(xì)葉山紫蘇、蕁麻、紫紅獐牙菜、女萎、忍冬15種提取物對(duì)TMV增殖的抑制活性顯著高于寧南霉素;其中香絲草提取物和水麻提取物處理組TMV含量與健康煙葉無(wú)差異，表明上述2種提取物能完全抑制TMV在烤煙K326體內(nèi)的增殖，說(shuō)明提取物中含有顯著抑制病毒增殖的活性物質(zhì)，值得深入研究。

　　圖2提取物間接ELISA檢測(cè)結(jié)果

　　H為健康葉片;N為DMSO處理的對(duì)照;P為寧南霉素處理的陽(yáng)性對(duì)照。

　　3、結(jié)論與討論

　　煙草花葉病毒在農(nóng)作物上是危害極為嚴(yán)重的侵染性病毒，其寄主范圍廣、防治難、危害大，給農(nóng)業(yè)上帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。煙草花葉病毒一般以粒子形式存在，當(dāng)煙草花葉病毒粒子侵入寄主后，病毒粒子的核酸和寄主的核糖體結(jié)合在一起，病毒借助寄主植物的代謝來(lái)復(fù)制自身蛋白，從寄主獲取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)也破壞了寄主組織細(xì)胞。當(dāng)病毒侵入寄主后，與寄主融為一體后，很難做到在不傷害寄主的前提下殺死病毒[15]。植物源抗病毒制劑由于毒副作用小，資源豐富，無(wú)殘留，高效的優(yōu)勢(shì)，在植物病毒病害防治過(guò)程中表現(xiàn)出重要的潛在價(jià)值[16]。

　　自1914年Allard首次發(fā)現(xiàn)商陸中存在抗病毒活性物質(zhì)后[17]，有關(guān)植物源抗TMV活性物質(zhì)的研究在逐漸增加，提取到相關(guān)的抗TMV活性植物小分子結(jié)構(gòu)有單寧、苦木素、生物堿等[18]。本試驗(yàn)研究了27種植物不同部分提取物的抗煙草花葉病毒活性。抑制作用研究結(jié)果表明，其中有8種植物的提取物對(duì)TMV侵染煙草具有一定的保護(hù)作用，12種植物的提取物具有不同程度的治療作用，9種植物的提取物具有直接鈍化作用，說(shuō)明不同種類(lèi)的植物具有不同的抗病毒作用方式。其中抑制TMV侵染活性顯著的提取物有馬桑、革命菜、蕁麻和藿香薊，其中馬桑提取物僅具有良好的保護(hù)活性，而后3種植物提取物同時(shí)具有鈍化和治療作用。上述幾種提取物的抗病毒活性顯著，有必要進(jìn)一步研究其中的抗TMV活性物質(zhì)。其中革命菜和藿香薊為入侵植物，危害生態(tài)環(huán)境，如能開(kāi)發(fā)利用將有效推動(dòng)它們的綜合治理[19]。篩選的27種植物中有一些是沒(méi)有抑制活性的，其提取物處理組的枯斑數(shù)比對(duì)照組枯斑數(shù)量多，表明這些提取物有利于病毒的侵染，可能含有協(xié)同TMV侵染的成分，陳啟建等研究有少數(shù)植物提取物對(duì)TMV侵染有促進(jìn)作用[20]。

　　植物病毒為專(zhuān)性寄生，若不能有效識(shí)別并侵染寄主，病毒無(wú)法復(fù)制基因組在寄主細(xì)胞內(nèi)增殖。病毒與寄主間的相互作用在病毒的繁殖和系統(tǒng)侵染中起到至關(guān)重要作用[21]。有效的植物抗病毒物質(zhì)可以直接靶向病毒核酸或蛋白來(lái)抑制病毒，或者調(diào)節(jié)寄主反應(yīng)(植物激素表達(dá)，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))來(lái)間接抑制病毒，進(jìn)而影響病毒與寄主間的平衡[22]。

　　植物提取物中的蛋白質(zhì)類(lèi)成分與煙草花葉病毒的病毒外殼蛋白相似，能與病毒爭(zhēng)奪寄主上的結(jié)合位點(diǎn);另一類(lèi)成分(單寧)可以和病毒外殼蛋白結(jié)合，形成病毒復(fù)合物，病毒外殼蛋白降低對(duì)侵染位點(diǎn)的識(shí)別能力，使病毒喪失侵染性[23,24]。本研究的植物提取物馬桑、革命菜、蕁麻和藿香薊，具有顯著的抑制病毒侵染活性，可能提取物中含有大量此類(lèi)物質(zhì)，影響了病毒外殼蛋白對(duì)寄主侵染位點(diǎn)的識(shí)別能力，抑制病毒的侵染。

　　植物提取物可以斷裂、凝聚侵入寄主的病毒粒子，使病毒失去增殖能力[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，27種提取物中有22種提取物能抑制TMV在烤煙K326中增殖，其中水麻提取物和香絲草提取物的OD405值接近健康葉片對(duì)照，說(shuō)明其抑制TMV增殖的作用效果最強(qiáng)。表明水麻和香絲草對(duì)普通煙K326內(nèi)的病毒增殖具有顯著的抑制作用，并且明顯高于陽(yáng)性對(duì)照藥劑寧南霉素。寧南霉素是目前研究較充分的植物病毒抑制劑，它可以和病毒外殼蛋白相互作用，并抑制TMV病毒粒子的聚合，使病毒不能復(fù)制[26]。另一主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，誘導(dǎo)寄主防御反應(yīng)是控制病毒的一種非常有效且對(duì)環(huán)境安全的方式[27]。病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)是由寄主識(shí)別受體(PRRs)感知病毒誘導(dǎo)的重要防御反應(yīng)[28]。寧南霉素能增強(qiáng)保守的寄主識(shí)別受體FLS2和RLK1對(duì)病毒的感知，有效激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)最終激活植物中的各種WRKY轉(zhuǎn)錄因子，積極調(diào)節(jié)PTI途徑來(lái)有效抑制TMV[29,30]。同時(shí)，寧南霉素能增強(qiáng)水楊酸(SA)信號(hào)響應(yīng)相關(guān)基因病程相關(guān)基因非表達(dá)子1(NPR1)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子WP-KY70表達(dá)，作用于SA響應(yīng)基因。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子WPKY70的高表達(dá)，抑制了茉莉酸(JA)響應(yīng)基因的表達(dá)[30,31]。SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)作用，使寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)，抑制TMV。此外，寧南霉素還參與RNA沉默。其能促進(jìn)鈣調(diào)素類(lèi)似蛋白CML46表達(dá)，使CML46與RNA沉默抑制因子RNA依賴(lài)性RNA聚合酶RDR1結(jié)合并降解，調(diào)節(jié)RNA沉默相關(guān)基因的表達(dá)，抑制TMV的復(fù)制[30,32,33]。

　　植物提取物能誘導(dǎo)寄主的病程相關(guān)蛋白(PR)，誘導(dǎo)寄主防御反應(yīng)，提高煙草對(duì)TMV的抗性[24];還能增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶活性，使清除TMV侵染寄主產(chǎn)生的超氧陰離子自由基和羥基自由基能力增強(qiáng)，進(jìn)而抑制TMV[24]。另外，植物提取物能干擾病毒外殼蛋白與病毒核酸的裝配，影響病毒有效的在寄主體內(nèi)長(zhǎng)距離的傳播[24]。水麻、香絲草提取物對(duì)TMV增殖的顯著抑制活性表明，提取物中可能含有能有效的靶向病毒核酸或蛋白，能誘導(dǎo)煙草病程相關(guān)蛋白、調(diào)節(jié)植物激素表達(dá)、PTI途徑等活性成分，進(jìn)而誘導(dǎo)寄主防御反應(yīng)，抑制TMV的增殖。詳細(xì)抑制TMV的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究以不同植物為研究對(duì)象，擴(kuò)大抗TMV活性物質(zhì)研究范圍，為今后的生物制劑的開(kāi)發(fā)提供一定基礎(chǔ)。

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