五環三萜釀酒酵母細胞工廠的構建

　　摘要α-香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇作為重要的五環三萜化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理學功能。為構建五環三萜釀酒酵母細胞工廠，本研究運用CRISPR/Csa9技術，分別將編碼長春花來源的α-香樹脂醇合酶(CrαAS)、洋甘草來源的羽扇豆醇合酶(GgLUS)和羊蹄甲來源的計曼尼醇合酶(BfGES)的基因整合至釀酒酵母基因組上，獲得工程菌株S01、S02和S03。工程菌株在YPG培養基中發酵48h，S01能生產50.7mg/Lα-香樹脂醇，S02羽扇豆醇產量達到45.8mg/L，S03計曼尼醇產量為17.6mg/L，表明五環三萜釀酒酵母細胞工廠構建成功。進一步在S01、S02和S03中過表達甲羥戊酸(MVA)途徑中的關鍵酶：鯊烯環氧酶(ERG1)，增加前體物質2,3-氧化鯊烯的供應，最終α-香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇產量分別達96.3、91.6和38.7mg/L。本研究建立了三萜微生物合成平臺，為構建五環三萜酸及其衍生物釀酒酵母細胞工廠奠定了理論和技術基礎。

　　本文源自食品與發酵工業 發表時間：2021-03-23《食品與發酵工業》雜志，于1970年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:11-1802/TS，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：行業技術、行業動態、政策法規標準等欄目等。

　　關鍵詞α-香樹脂醇;羽扇豆醇;計曼尼醇;五環三萜;合成生物學;釀酒酵母

　　三萜類化合物是一類由多個異戊二烯單位(C5H8)構成的烴類及其含氧衍生物，通常是由30個碳原子組成。結構上多為四環三萜或五環三萜，其中，五環三萜化合物種類較多，而且結構復雜，廣泛存在于植物中，具有多種藥理學功能，如齊墩果酸片等藥品已在臨床應用于肝臟保護[1-2]。根據構型不同，五環三萜化合物可分為烏蘇烷型(ursanegroup)、羽扇豆烷型(lupanegroup)和齊墩果烷型(oleananegroup)等。α-香樹脂醇(α-amyrin)及其衍生物是重要的烏蘇烷型五環三萜，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗真菌[5]等功效;羽扇豆醇(lupeol)及其衍生物是羽扇豆烷型五環三萜的代表，在抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有非常重要的作用;計曼尼醇(germanicol)及其衍生物屬于齊墩果烷型五環三萜，被廣泛應用于食品、醫藥和精細化工品等[8]領域。目前五環三萜化合物主要從植物中提取得到，此方法耗時、成本高、環境不友好，隨著合成生物學的快速發展，利用微生物實現萜類化合物的異源生產得到了越來越多的關注[9-10]。

　　釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為一種安全的真核模式微生物，遺傳背景清晰，遺傳操作技術成熟，具有生物合成萜類物質的甲羥戊酸(MVA)途徑，其完整的細胞內膜系統更加有利于萜類合成相關環化酶和細胞色素P450氧化酶的表達，已被廣泛用于構建生產天然萜類活性物質的底盤工程菌株[11-13]。YU等[14]將α-香樹脂醇合酶MdOSC1引入釀酒酵母中，通過代謝工程改造增加前體物質2,3-氧化鯊烯的供應，α-香樹脂醇的搖瓶產量達到12.0mg/L。QIAO等[15]將羽扇豆醇合酶OeLUP在釀酒酵母進行異源表達，實現了羽扇豆醇的生物合成。ZHANG等[16]在釀酒酵母中構建了β-香樹脂醇合成途徑，并對其合成途徑進行調控和發酵優化，β-香樹脂醇產量達138.8mg/L。在重組釀酒酵母中，五環三萜化合物是以MVA途徑產生的異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)為前體，依次在法呢基焦磷酸合酶(ERG20)、鯊烯合酶(ERG9)和鯊烯環氧酶(ERG1)的催化作用下生成2,3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene)，2,3-氧化鯊烯進一步在α-香樹脂醇合酶(α-amyrinsynthase，αAS)、羽扇豆醇合酶(lupeolsynthase，LUS)和計曼尼醇合酶(germanicolsynthase，GES)的作用下生成相應的三萜母核[8]。

　　本研究以Keasling教授惠贈的高效積累IPP和DMAPP的釀酒酵母菌株JWy601[17]為出發菌株，運用CRISPR/Csa9技術[18]，整合長春花來源的α-香樹脂醇合酶，構建得到α-香樹脂醇生物合成途徑;異源表達洋甘草來源的羽扇豆醇合酶，獲得產羽扇豆醇釀酒酵母工程菌株;引入羊蹄甲來源的計曼尼醇合酶，實現計曼尼醇的生物合成。進一步通過代謝工程策略過表達MVA代謝途徑中的關鍵酶ERG1，增加前體物質2,3-氧化鯊烯的供應，提高五環三萜的產量。本研究建立了三萜微生物合成平臺，為構建五環三萜酸及其衍生物釀酒酵母細胞工廠奠定了理論和技術基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1質粒和菌株

　　實驗所用質粒和菌株信息詳見表1。

　　1.1.2引物

　　實驗所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，如表2所示

　　1.1.3培養基

　　LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，培養大腸桿菌時向培養基中加入終濃度為100µg/mL的氨芐青霉素(Amp)或50µg/mL的卡那霉素(Kan)。酵母尿嘧啶營養缺陷型培養基(g/L)：酵母SC-URA培養基7.9，葡萄糖20。YPD培養基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。YPG培養基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，半乳糖20。若需要固體培養基，向上述液體培養基加入20g/L瓊脂粉。

　　1.1.4主要試劑和儀器

　　GreenTaqMix和2×PhantaMaxMasterMix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司;酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;質粒小量制備試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司;氨芐青霉素和卡那霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母SC-URA培養基，艾禮生物科技(上海)有限公司;α-香樹脂醇和羽扇豆醇標準品，上海源葉生物科技有限公司;計曼尼醇標準品，云南西力生物技術股份有限公司。

　　Bio-RadC1000TOUCH型PCR儀，美國伯樂公司;EPS300型核酸電泳系統，上海天能科技有限公司;LDZM-80KCS-II型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;CT15RE型高速冷凍離心機，日本日立公司;ZQZY-HC型振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司;PegasusBT型氣相-高通量飛行時間質譜儀，美國力可公司。

　　1.2方法

　　1.2.1五環三萜合成途徑的構建

　　本實驗所選取的表達五環三萜合成途徑相關酶的編碼基因來源情況如下：α-香樹脂醇合酶編碼基因CrαAS來源于長春花(Catharanthusroseus)，羽扇豆醇合酶編碼基因GgLUS來源于洋甘草(Glycyrrhizaglabra)，計曼尼醇合酶編碼基因BfGES來源于羊蹄甲(Bauhiniaforficata)。以上基因由蘇州金唯智生物科技有限公司按照釀酒酵母密碼子偏好性進行優化、合成并克隆至質粒pET28a上，得到重組質粒：pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES。在此基礎上，以菌株JWy601基因組為模板，通過表2中所示的引物，分別擴增獲得ERG1、PGAL1、TADH1和不同位點的上下游同源臂片段;以質粒pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES為模板，表2中所示的序列為引物，分別擴增獲得CrαAS、GgLUS和BfGES基因片段;同時，提取pCut-308a和pCut-1622b質粒，用于構建釀酒酵母五環三萜合成途徑。

　　1.2.2工程菌株的篩選

　　本研究利用的CRISPR-Cas9基因編輯系統[18]是一個單質粒系統，pCut-308a和pCut-1622b質粒攜帶有表達Cas9蛋白的基因和靶向相應位點的sgRNA，用來進行基因的靶向整合。首先將CrαAS、GgLUS和BfGES基因分別整合至釀酒酵母基因組308a位點，獲得菌株S01、S02和S03;進一步整合ERG1基因至菌株S01、S02和S03的1622b位點，分別獲得菌株S04、S05和S06。具體篩選方法如下所述：首先通過釀酒酵母醋酸鋰轉化法，分別把1.2.1中得到的基因片段與上下游同源臂、PGAL1、TADH1和pCut質粒共轉化至釀酒酵母，利用同源重組機制實現PGAL1-目的基因-TADH1表達盒的組裝;接下來將轉化平板倒置于30℃培養箱中培養，待長出轉化子后對其進行PCR驗證，完成第一次篩選;最后對驗證成功的轉化子進行傳代培養，待質粒成功消除后進行第二次PCR驗證，進一步測序確認最終獲得整合表達氧化鯊烯環化酶和ERG1的工程菌株。

　　1.2.3工程菌株的發酵

　　凍管菌經YPD平板劃線活化后，接種于10mLYPD培養基中，于30℃、200r/min條件下振蕩培養24h;隨后轉接至50mLYPD培養基中，使其初始菌體濃度OD600=0.2，30℃、200r/min振蕩培養24h;然后離心收集菌體，更換50mLYPG培養基誘導表達，定時取樣對重組菌生長趨勢、α香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇產量進行測定。

　　1.2.4工程菌株產物的提取

　　對發酵過程中的樣品進行快速提取，具體方法如下所述：取1mL發酵液，12000r/min室溫離心1min收集菌體，用等體積20%氫氧化鉀溶液(用50%乙醇配制)重懸，沸水浴10min;加入等體積正己烷萃取3次，離心取上清;用無水硫酸鈉除水后對樣品進行硅烷化處理，轉移至氣相小瓶中用氣相-高通量飛行時間質譜儀分析。

　　1.2.5產物的分析與檢測

　　氣相-高通量飛行時間質譜儀(GC-MS)測定：色譜柱為DB-5MS，載氣氦氣的流速為1.0mL/min;進樣口溫度300℃，分流進樣，進樣量1µL，分流比10:1;升溫起始溫度180℃，保持1min，然后以20℃/min升至300℃，保持14min;質譜掃描范圍為50-600m/z。α-香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇標準品用于定性和定量分析。

　　2結果與分析

　　2.1α-香樹脂醇細胞工廠構建及產物分析

　　在釀酒酵母中引入植物來源的α-香樹脂醇合酶可催化2,3-氧化鯊烯生成α-香樹脂醇[14]。本研究選取來源于長春花的α-香樹脂醇合酶CrαAS(GenBankID:JQ027033.1)用于構建α-香樹脂醇細胞工廠。在釀酒酵母JWy601中整合CrαAS基因，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，PCR產物大小與表達盒理論值大小3139bp一致，測序結果進一步表明，本實驗成功構建得到整合有α-香樹脂醇合酶CrαAS的釀酒酵母工程菌株S01。

　　工程菌株S01在YPG培養基中發酵96h，利用GC-MS對發酵產物進行分析。結果如圖2a所示，工程菌株S01發酵產物在14.24min時出現與α-香樹脂醇標準品保留時間一致的峰，實現了釀酒酵母發酵生產α-香樹脂醇。工程菌株S01菌體生長曲線和α-香樹脂醇產量變化曲線如圖2b所示，誘導發酵48h時產量最高，達到50.7mg/L。

　　2.2羽扇豆醇細胞工廠構建及產物分析

　　羽扇豆醇合酶可以將2,3-氧化鯊烯環化生成羽扇豆烷型三萜母核羽扇豆醇[15]。本研究把洋甘草來源的羽扇豆醇合酶GgLUS(GenBankID:AB116228.1)整合到釀酒酵母中，用于構建生產羽扇豆醇的工程菌株。以釀酒酵母JWy601為出發菌株，把GgLUS基因整合至其基因組上，PCR驗證結果如圖3所示，所得條帶大小3127bp，與表達盒理論值大小相符，測序結果也顯示表達盒構建成功，獲得表達羽扇豆醇合酶GgLUS的釀酒酵母工程菌株S02。

　　對工程菌株S02進行搖瓶發酵實驗，提取發酵液樣品，萃取后用GC-MS進行定性和定量分析。總離子流色譜圖如圖4a所示，羽扇豆醇標準品在14.30min時出峰，工程菌株S02發酵產物在該時間點也出峰，表明成功構建產羽扇豆醇釀酒酵母細胞工廠。工程菌株S02在YPG培養基中誘導表達48h時，羽扇豆醇產量高達45.8mg/L(圖4b)。

　　2.3計曼尼醇細胞工廠構建及產物分析

　　齊墩果烷型三萜母核計曼尼醇是以2,3-氧化鯊烯為前體物質，在計曼尼醇合酶的作用下環化而成的[8]。本研究將來源于羊蹄甲的計曼尼醇合酶BfGES(GenBankID:LC464979.1)在釀酒酵母中異源表達，構建計曼尼醇生物合成途徑。把BfGES基因整合至釀酒酵母JWy601底盤細胞中，PCR驗證結果如圖5所示，所得DNA片段大小與表達盒大小理論值一致(3148bp)，進一步測序確認計曼尼醇合成途徑構建成功，獲得釀酒酵母工程菌株S03。

　　工程菌株S03在YPD培養基中培養24h后，更換YPG培養基進行誘導表達，提取發酵液樣品，用GC-MS對其進行檢測。產物檢測結果如圖6a所示，在14.36min時，計曼尼醇標準品和工程菌株S03發酵產物均出峰，表明產計曼尼醇釀酒酵母工程菌株構建成功。由工程菌株S03菌體生長曲線和計曼尼醇產量變化曲線圖(圖6b)可看出，計曼尼醇產量先快速升高，后緩慢下降，在誘導48h時達到最高17.6mg/L。

　　2.4過表達ERG1基因對釀酒酵母五環三萜產量的影響

　　MVA途徑作為細胞中乙酰輔酶A轉化為萜類化合物的第1個關鍵模塊，其活性會直接影響到細胞中萜類產量，其中，ERG1是釀酒酵母MVA代謝途徑中的關鍵酶。ERG1基因編碼鯊烯環氧酶，其作用是把鯊烯氧化生成2,3-氧化鯊烯。ZHANG等[19]用同源重組的方法過表達ERG1基因，提高了釀酒酵母工程菌株中達瑪二烯和原人參二醇的產量。

　　因此，為進一步提高本研究構建得到的釀酒酵母工程菌株產五環三萜能力，本研究在先前工作的基礎上，通過代謝工程策略對菌株S01、S02和S03進行了改造。即在菌株S01、S02和S03中過表達ERG1基因，分別得到菌株S04、S05和S06。工程菌株在YPG培養基中發酵48h，結果如圖7所示，菌株S04中α-香樹脂醇的產量為96.3mg/L，是菌株S01的1.9倍;菌株S05中羽扇豆醇的產量達到91.6mg/L，是菌株S02的2倍;菌株S06中計曼尼醇產量達到了38.7mg/L，是菌株S03的2.2倍。研究結果表明增加前體物質的供應可顯著增強工程菌株五環三萜的生產能力。本研究獲得的菌株S04中α-香樹脂醇的產量和菌株S05中羽扇豆醇的產量與已有報道水平相當，菌株S06中計曼尼醇產量是已報道的4.7倍，后續會開展合成途徑與發酵工藝優化工作提高五環三萜的產量。

　　3討論

　　目前三萜類化合物的合成主要是通過植物提取，成本高效率低，本研究以安全的真核模式微生物釀酒酵母為底盤細胞，分別整合不同來源的氧化鯊烯環化酶并利用代謝工程策略提高其產量，構建產五環三萜的微生物細胞工廠。本研究獲得的工程菌株S04α-香樹脂醇產量達到96.3mg/L，α-香樹脂醇是烏蘇烷型三萜的前體，在氧化還原反應、酰基化、糖基化等修飾作用下，能形成結構和功能各異的烏蘇烷三萜，其C-28位連續氧化產物熊果酸有抗癌、抗糖尿病及抗潰瘍降血脂的作用[20]。工程菌株S05羽扇豆醇產量可達91.6mg/L，羽扇豆醇屬于羽扇豆烷型三萜化合物，其衍生物白樺脂酸被認為是很有前景的抗腫瘤及抗HIV的候選藥物[21]。工程菌株S06可生產38.7mg/L計曼尼醇，計曼尼醇屬于齊墩果烷型三萜，齊墩果烷型三萜化合物具有廣泛的藥理活性，齊墩果酸[20]和甘草酸類[22]藥物制劑已在臨床應用于肝臟保護。隨著三萜類化合物合成途徑的解析，后續研究可在產五環三萜骨架釀酒酵母合成途徑與發酵工藝優化的基礎上，進一步整合氧化三萜骨架的細胞色素P450氧化酶[23-25]，用于生產活性更高的三萜化合物。本研究建立了三萜微生物合成平臺，為構建五環三萜酸及其衍生物釀酒酵母細胞工廠奠定了理論和技術基礎。