EuDQD/SDH6基因在巨尾桉莽草酸途徑中的功能分析

　　摘 要 莽草酸脫氫酶家族是多酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵分支酶，本研究體外分離獲得巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因(KY401152.1)，在大腸桿菌中表達(dá)并純化了 DQD/SDH6 蛋白，以莽草酸為底物的 DQD/SDH6 酶動力學(xué)參數(shù)為 Km=29.93 mmol/L，Vmax=(149.96±0.003) mmol L-1 s -1，表明該蛋白具有 SDH 活性。實(shí)時定量 PCR 技術(shù)研究 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn) EuDQD/SDH6 主要在葉片中表達(dá)，其次是莖部，根部最少，隨著葉片的成熟 EuDQD/SDH6 的表達(dá)量也逐漸減少。綜合分析了實(shí)時定量 PCR、SDH 酶活性和 HPLC 法測定的酚酸含量的數(shù)據(jù)，研究巨尾桉 DQD/SDH6 的酶功能。EuDQD/SDH6 的基因表達(dá)量與 SA、 PCA 累積量均呈負(fù)線性相關(guān)，與 GA 累積量正線性相關(guān)，但關(guān)聯(lián)性較弱，推測桉樹 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3 脫氫莽草酸為底物合成沒食子酸，為單寧合成提供前體。EuDQD/SDH6 基因的表達(dá)量與硫酸木質(zhì)素的含量呈正相關(guān)，推測 EuDQD/SDH6 基因的表達(dá)影響木質(zhì)素在巨尾桉中的累積。

　　本文源自趙艷玲; 王梅， 分子植物育種 發(fā)表時間：2021-05-10《分子植物育種》(雙月刊)創(chuàng)刊于2003年，由海南省生物工程協(xié)會主辦。是一份為轉(zhuǎn)基因育種、分子標(biāo)記輔助育種及常規(guī)育種服務(wù)的國際化科學(xué)期刊，內(nèi)容涉及了水稻、小麥、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯類、果樹、蔬菜、花卉、茶葉、林草等多方面，主要是刊登分子遺傳育種理論、分子育種方法、分子育種研究動態(tài)以及優(yōu)良種質(zhì)培育的科學(xué)論文報(bào)道。

　　關(guān)鍵詞 巨尾桉; 莽草酸脫氫酶; 沒食子酸; 莽草酸; 原兒茶酸; 木質(zhì)素

　　微生物和植物中的芳香族氨基酸及大量次級代謝物如鞣酸、單寧等通過莽草酸途徑獲得必要的前體。莽草酸脫氫酶(簡稱 SDH)家族分為五類功能酶，具有高度保守的 α/β 折疊三維結(jié)構(gòu)，因活性中心殘基和幾何結(jié)構(gòu)的輕微不同而具有不同的底物特異性(Peek and Christendat, 2015)。植物莽草酸脫氫酶基因的沉默會影響植物的莖高生長并出現(xiàn)芳香族氨基酸缺乏等現(xiàn)象(Ding et al., 2007)。

　　在植物中，SDH 通過 N 端與脫氫奎寧酸脫水酶(DQD)結(jié)合，形成 DQD/SDH 復(fù)合酶。不同的植物因生理特性不同，具有不同的 DQD/SDH 基因數(shù)量，在耐鋁脅迫的赤桉(Tahara et al., 2021)，成熟的葡萄果實(shí) (Bontpart et al., 2016)、石榴的外表皮(Guo et al., 2014)和山茶的葉片(Huang et al., 2019)中分離到四類 DQD/SDH 基因，白楊編碼五種 DQD/SDH 基因(Habashi et al., 2019)。赤桉 EcDQD/SDH1 為經(jīng)典的植物 DQD/SDH 雙功能酶，EcDQD/SDH4a/b 為依賴 NAD+/NADH 的奎尼酸脫氫酶，EcDQD/SDH2 和 3 為鋁的解毒代謝物的生物合成提供必需的沒食子酸鹽(Tahara et al., 2021)。白楊的 poptr1 和 poptr5 皆有典型的 DQD/SDH 雙功能特性，而 poptr2 和 poptr3 則以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+ )為輔因子催化奎尼酸形成 3- 脫氫奎尼酸，具有奎尼酸脫氫酶(QDH)活性，DQD 和 SDH 活性最少，只占總活性的 1% (Guo et al., 2014)。

　　莽草酸脫氫酶作為多酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵分支酶，而酚酸種類豐富且大量的巨尾桉具有不同于其他植物的特點(diǎn)。本研究分離了巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合分析該基因在巨尾桉莽草酸脫氫酶家族中的酶功能，為進(jìn)一步解析桉樹莽草酸脫氫酶家族奠定研究基礎(chǔ)。

　　1 結(jié)果與分析

　　1.1 巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因的分離與生物信息學(xué)分析

　　根據(jù)桉樹基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，分離純化約 1500bp 符合目的基因的條帶，委托華大基因公司測序， Genebank 注冊號 KY401152.1。EuDQD/SDH6 開放閱讀框全長為 1593bp，預(yù)測分子量為 57.48kD，等電點(diǎn)為 7.36。利用在線 IterPro 預(yù)測 EuDQD/SDH6 屬于莽草酸脫氫酶超家族，也屬于脫氫奎尼酸脫水酶第一類。利用 MEGA5.0 檢測其他不同植物的 DQD/SDHs 的序列相似性，構(gòu)建鄰接樹如圖(圖 1)。結(jié)果表明 EuDQD/SDH6 與 VvSDH3、EgSDH3、FvSDH1 等屬于 DQD/SDH 第三分類，平均序列相似性為 85%，猜測 EuDQD/SDH6 功能可能是以 GA 為前體合成單寧，在植物體內(nèi)積累水解單寧(Bontpart et al., 2016)。

　　1.2 EuDQD/SDH6 的原核表達(dá)和酶動力學(xué)

　　圖中表明 PET-euDQD/SDH6 原核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖 2)，預(yù)測 PET-euDQD/SDH6 融合蛋白條帶可能在 60~70kD 附近，獲得原核表達(dá)的融合蛋白(圖 3)。用 Ni-NTA-瓊脂糖親和純化 His6 標(biāo)記的重組蛋白，根據(jù) Michaelis-Menten 線性擬合得到最大速率 Vmax 和米氏常數(shù) Km (表 1)，以莽草酸為底物、NADP+為輔因子的緩沖環(huán)境中，DQD/SDH6 的 Km 值為(29.93±0.17) mmol/L，具有功能特性的 DQD/SDHs，其重組酶 Km 值范圍大都在 130~860 μmol/L 之間(Ding et al., 2007; Muir et al., 2011;Tahara et al., 2021; Habashi et al., 2019)，說明 DQD/SDH6 以莽草酸為底物的莽草酸脫氫酶活性較低。

　　1.3 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表達(dá)模式

　　以 18S 為內(nèi)參基因 qPCR 檢測巨尾桉組培苗中 EuDQD/SDH6 在不同組織中的表達(dá)模式，EuDQD/SDH6 主要在葉片表達(dá)，其次是莖部，在根系表達(dá)量極低，以根系為對照，EuDQD/SDH6 在葉片的表達(dá)量是根系的 20 倍左右(圖 4A)。且 EuDQD/SDH6 主要在幼齡葉中表達(dá)，隨著葉片的成熟表達(dá)量隨之降低，上層幼齡葉的表達(dá)量是下層老齡葉表達(dá)量的 121 倍(圖 4B)

　　定量 PCR 技術(shù)篩選實(shí)驗(yàn)室保存的木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因巨尾桉 P40、P41 (趙艷玲等, 2018)、F52、 F71、F76 (趙艷玲等, 2019)的 EuDQD/SDH6 基因表達(dá)水平，P40、P41 是過表達(dá) CuZnSOD 的轉(zhuǎn)基因桉樹， F52、F71、F76 是過表達(dá) CuZnSOD+低表達(dá) 4CL1 基因的轉(zhuǎn)基因桉樹，篩選到三株 P41、F52、F71 轉(zhuǎn)基因植株的 EuDQD/SDH6 基因表達(dá)水平較低，其中 F52 的 EuDQD/SDH6 表達(dá)水平最低，與對照組相比下降了 91%。

　　1.4 轉(zhuǎn)基因巨尾桉的 SDH 酶活測定

　　檢測篩選的 5 株轉(zhuǎn)基因巨尾桉的 SDH 酶活性，與野生植株相比，轉(zhuǎn)基因巨尾桉的 SDH 活性均有增加，其中 F71 的比活力最高，高達(dá)(3.45±0.29)×107 nmol·min-1 ·mg -1，是對照組的 2.22 倍。

　　1.5 轉(zhuǎn)基因巨尾桉的莽草酸、沒食子酸和原兒茶酸含量

　　轉(zhuǎn)基因巨尾桉的莽草酸含量均高于對照組，其中植株 F52 莽草酸累積量增加 1.12 倍，而植株 P41 的莽草酸累積量增加 8.19 倍。GA 累積量均低于野生型巨尾桉，并呈現(xiàn)不同程度的減少，其中植株 P40 的 GA 累積量降幅最大，與對照組相比降低 55.75%。轉(zhuǎn)基因巨尾桉 P41、F52、F71、F76 的 PCA 累積量均小幅度的高于野生型巨尾桉，其中 P41 的原兒茶酸含量相對于對照組增加 3.28 倍，與之相反的是植株 P40 的 PCA 累積量呈現(xiàn)輕微的減少。

　　1.6 EuDQD/SDH6 與酚類物質(zhì)含量的相關(guān)性

　　轉(zhuǎn)基因桉樹的硫酸木質(zhì)素含量數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn) [11,12]，以 EuDQD/SDH6 基因表達(dá)水平與硫酸木質(zhì)素含量之間計(jì)算，二者的相關(guān)系數(shù) r≈0.64，呈顯著正線性相關(guān)，EuDQD/SDH6 基因可能影響木質(zhì)素在巨尾桉中的積累。以轉(zhuǎn)基因巨尾桉 SDH 總酶活與硫酸木質(zhì)素含量計(jì)算二者之間的相關(guān)系數(shù) r≈-0.88，說明 SDH 的高表達(dá)會降低轉(zhuǎn)基因巨尾桉中木質(zhì)素的累積量。

　　EuDQD/SDH6 的基因表達(dá)水平與 SA、PCA 累積量之間呈負(fù)線性相關(guān)，但 SDH 酶活與 SA 累積量之間呈正線性相關(guān)，與 PCA 累積量的正線性相關(guān)相對較弱。數(shù)據(jù)表明 EuDQD/SDH6 基因表達(dá)與 GA 累積量之間存在正線性相關(guān)，但該關(guān)聯(lián)性較弱，而 SDH 酶活與轉(zhuǎn)基因巨尾桉的 GA 累積量之間存在著較弱的負(fù)線性相關(guān)。

　　2 討論

　　Bontpart 等(2016)分析部分雙子葉植物的 DQD/SDH 基因序列，將其分成五類：第一類葡萄 VvSDH1、擬南芥 AtSDH(Tahara et al., 2021)、胡桃 JrSDH (Muir et al., 2011)、煙草 NtSDH1 (Ding et al., 2007)，序列相似性達(dá) 75%;第二類葡萄 VvSDH2、楊樹 poptr2、poptr3 和煙草 NtSDH2，序列相似性平均為 71%;第三類 VvSDH3、野茶樹 CasSDH2 (Jiang et al., 2013)、草莓 FvSDH1 (Rivas-Sendra et al., 2011)和桉樹 EgSDH3(Boulekbache-Makhlouf et al., 2010)序列相似性最高，高達(dá) 85%;第四類葡萄 VvSDH4 和楊樹 poptr5, 序列相似性為 77%;第五類楊樹 poptr4 和桉樹 EgSDH1 等，目前未見生理特性的研究分析，序列相似性平均為 68%。本研究構(gòu)建的鄰接樹里，EuDQD/SDH6 與 VvSDH3、CasSDH2、FvSDH1 等歸為第三類植物 DQD/SDH，而先前已經(jīng)有研究證明這四種植物體內(nèi)積累較高的以 GA 為底物合成的單寧化合物，因此推測桉樹 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3-DHS 為底物合成沒食子酸，為單寧合成提供前體。

　　利用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算公式分析酚酸含量與 EuDQD/SDH6 基因、SDH 酶活和木質(zhì)素含量之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SA、PCA 含量與 EuDQD/SDH6 之間呈負(fù)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.51、-0.50，-0.51、-0.57，但與 SDH 酶活之間卻呈正線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.61、0.38，說明在巨尾桉中具有一個復(fù)雜的莽草酸脫氫酶家族。EuDQD/SDH6 的基因表達(dá)水平能較弱的影響 GA 在植物體的累積量;GA 累積量也受 SDH 酶活的影響，當(dāng) SDH 酶活力增加時，GA 累積量呈下降趨勢，暗示 GA 的合成與 SDH 家族酶關(guān)系較小。推測可能存在其他合成 GA 的酶，其以莽草酸作為底物催化產(chǎn)生 GA 的能力較差，或者是否在桉樹中存在 GA 合成相關(guān)的抑制作用，這些推測還尚未得到證明(Wu and Dutta, 2017)。3-脫氫莽草酸作為中間物既能被 SDH 催化形成 SA，又能被催化生成 GA，而 3-DHS 到 PCA 的途徑在植物中的研究尚不清晰，此步驟在植物中是由酶催化的還是無酶催化的還未有定論(Wu and Dutta, 2017; Kim et al., 2018)。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析硫酸木質(zhì)素與 SDH 酶活之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間相關(guān)系數(shù)為-0.88，表明 SDH 的過量表達(dá)能顯著降低轉(zhuǎn)基因巨尾桉中木質(zhì)素的累積。在擬南芥中表達(dá)棒狀桿菌的脫氫莽草酸脫水酶基因，該酶催化 3-脫氫莽草酸生成 PCA，降低了轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞壁木質(zhì)素的堆積(Eudes et al., 2016)。至于 SDH 表達(dá)水平的變化是否能改變木質(zhì)素的累積量還要通過構(gòu)建 SDH 轉(zhuǎn)基因植株來進(jìn)一步驗(yàn)證。

　　3 材料與方法

　　3.1 試驗(yàn)材料

　　巨尾桉組培苗、盆栽苗、轉(zhuǎn)基因苗、大腸桿菌 E.coli DH5α、E.coli BL21、pET-32a 等為本實(shí)驗(yàn)室保存。 cDNA 合成試劑盒、RNA 提取試劑盒、定量 PCR 試劑盒和相關(guān)的酶試劑購自 TaKaRa，His-tag Protein purification Kit(常州天地人和生物科技)。

　　3.2 基因分離與生物信息學(xué)分析

　　參照巨尾桉 RNA 克隆方法(趙艷玲和姚婕, 2017)，設(shè)計(jì)引物 EuDQD/SDH6：SDH6F：5’ATGGGCAGCG TTCCGTTCAC 3’，SDH6R：5’ATGGGCAGCGTTCCGTTCAC 3’，分離陽性克隆子，委托華大基因測序，NCBI 數(shù)據(jù)庫注冊基因序列。蛋白質(zhì)家族及保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 InterProScan (http://www.ebi.ac.uk /Tools/InterPro Scan/)，MEGA5.2 建鄰接樹。

　　3.3 基因原核表達(dá)和酶活性測定

　　BamH?和HindⅢ雙酶切pMD-SDH和pET-32a連接構(gòu)建PET-euDQD/SDH6，并委托華大基因測序。IPTG 誘導(dǎo) DQD/SDH6 蛋白表達(dá)，參照(Habashi et al., 2019)誘導(dǎo)重組蛋白。Ni-NTA beads 6FF 親和純化 His6 標(biāo)記重組蛋白，Bradford 法測定蛋白含量，EuDQD/SDH6 酶動力學(xué)參數(shù)以莽草酸(SA)為底物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+ )為輔因子、pH=7 的條件下檢測。

　　3.4 實(shí)時定量 PCR 測定基因表達(dá)量

　　參照(趙艷玲和姚婕, 2017)利用定量 PCR 方法分析巨尾桉組培苗的三個植物組織(根, 莖, 葉)、1 年生轉(zhuǎn)基因桉樹盆栽苗不同葉齡(幼葉, 中葉, 老葉)的 EuDQD/SDH6 表達(dá)量，以巨尾桉 18s rRNA 為內(nèi)參基因 Eg18S3：5’CATGGCCGTTCTTAGTTGGT3’，Eg18S4：5’TAGCAGGCTGAGGTCTCGTT3’，EuDQD6(1)： 5’CATTGTGAGAAGGCCTGATG3’，EuDQD6(2)：5’CAGCTAATGGTGAGGCTCCT3’，依相對定量法計(jì)算 EuDQD/SDH6 基因的表達(dá)量。

　　3.5 轉(zhuǎn)基因巨尾桉 SDH 活性測定方法

　　液氮研磨巨尾桉葉片約 2 g，4 mL 蛋白提取緩沖液抽提，4 ℃ 13 000 g 離心 25 min，取上清為 SDH 蛋白粗提液。Bradford 法測定蛋白含量，以莽草酸(SA)為底物、NADP+為輔因子，紫外分光光度計(jì)測定 5 min 內(nèi) NADPH 在 340 nm 的吸光度值變化測定莽草酸脫氫酶活性，計(jì)算酶活和比活(Bontpart et al., 2016)。

　　3.6 HPLC 法測定莽草酸、沒食子酸和原兒茶酸

　　液氮研磨葉片，收集 2.0 g 粉末于錐形瓶中，加入 20 mL 的 50%甲醇。超聲儀中提取 60 min，待錐形瓶冷卻至室溫稱重，用 50%甲醇補(bǔ)足重量。0.22 μm 濾膜過濾。HPLC 儀器為 Agilent 高效液相色譜儀，色譜柱為 welch XB-C18 柱(4.6 mm×150 mm, 3 μm)。流動相為乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 218 nm 測定莽草酸(SA)含量;流動相為甲醇-0.1%磷酸(5:95)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 270 nm 測定沒食子酸(GA)含量;流動相為乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為 258 nm 測定原兒茶酸(PCA)含量。

　　3.7 酶活性、基因表達(dá)量和次級代謝物的相關(guān)性

　　以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算 EuDQD/SDH6 的表達(dá)水平及 SDH 酶活的大小與植物中各類次級代謝物的含量的關(guān)系，相關(guān)系數(shù)計(jì)算公式如下：相關(guān)系數(shù) r= x、y：兩個指標(biāo)

　　作者貢獻(xiàn)

　　趙艷玲、王梅是本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)研究的執(zhí)行人;王梅完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作;趙艷玲是項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析，論文寫作與修改。兩位作者都閱讀并同意最終的文本。

　　致謝

　　本研究由福建省科技廳引導(dǎo)性科研項(xiàng)目(2018N0018)資助。