梁山慈竹DfMYB3基因克隆及啟動子分析

　　摘要 基于梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以梁山慈竹葉片為材料，克隆得到一個MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為DfMYB3，其開放閱讀框長度為 1 287 bp，編碼 428 個氨基酸，GenBank 注冊號為 KY963358。保守結構域分析顯示，Df? MYB3有典型的SANT結構域，具有DNA-Binding結構域。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，DfMYB3與甘蔗、擬南芥、毛白楊等物種的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子聚集在一枝上。亞細胞定位結果顯示，DfMYB3蛋白在細胞核以及細胞膜中均有表達，在細胞核上更為顯著。通過染色體步移法克隆得到 DfMYB3基因 5′側翼 2 000 bp左右的序列。Plant? CARE在線軟件分析表明，該序列具有典型的啟動子特征，并含有 GA、ABA、MeJA等激素以及干旱等脅迫響應元件。100 μmol·L-1 GA、100 μmol·L-1 ABA處理梁山慈竹后，顯著上調(diào)了 DfMYB3基因的表達，表明 DfMYB3基因能對 GA及 ABA處理產(chǎn)生應答。為探究 DfMYB3啟動子的功能，構建了 DfMYB3啟動子融合 GUS基因的表達載體，并遺傳轉(zhuǎn)化煙草。在轉(zhuǎn)基因煙草葉片及莖桿中都檢測到了GUS信號，在葉脈處最為顯著。

　　本文源自杜恬恬; 李會萍; 王博雅; 歐倩; 黃艷; 曹穎; 胡尚連， 植物研究 發(fā)表時間：2021-05-07《植物研究》1959年創(chuàng)刊，是由東北林業(yè)大學主辦，科學出版社出版的植物學專業(yè)刊物，是國內(nèi)外公開發(fā)行的學術期刊。2006年變更為雙月刊。《植物研究》本刊是以植物分類、基因工程、植被生態(tài)、數(shù)量遺傳學等為核心的多學科綜合性學術期刊。

　　關鍵詞 梁山慈竹; MYB轉(zhuǎn)錄因子;啟動子;GA、ABA處理;GUS染色

　　MYB轉(zhuǎn)錄因子是最重要的植物轉(zhuǎn)錄因子大家族之一，參與了植物生長的許多生理過程。第一個從植物中獲得的 MYB 基因是玉米的 Clorless1 (C1)轉(zhuǎn)錄因子[1]，隨后在棉花[2]、大豆[3]、擬南芥[4]等植物中的 MYB 蛋白也被鑒定出來。MYB 轉(zhuǎn)錄因子結構域中包含DNA-Binding結構域，根據(jù)結構的不同，可分為 1R-MYB、2R-MYB(R2R3-MYB)、 3R-MYB(R1R2R3-MYB)和4R-MYB 4類蛋白[5]，其中 R2R3-MYB 是最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了植物的生長發(fā)育調(diào)控[6]、次生壁的形成[7]、初級和次級代謝[8]、脅迫響應以及激素應答[9]等。如棉花 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 GhMYB7 在棉纖維發(fā)育中高表達，GhMYB7過表達擬南芥會增加維管和胞間纖維的細胞壁厚度，以及激活次生壁生物合成相關基因的表達，導致纖維素和木質(zhì)素的異位沉積[10]。擬南芥 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子 AtMYB60在萵苣中抑制會花青素的合成，過表達 AtMYB60 會導致萵苣花青素的產(chǎn)生和積累受到抑制[11]。麻瘋樹 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 JcMYB1 經(jīng)干旱、聚乙二醇、氯化鈉和冷處理后表達量均上調(diào)，ABA 和茉莉酸處理也可上調(diào) JcMYB1 的表達，而乙烯不誘導 Jc? MYB1 的表達，揭示了 JcMYB1 在響應非生物脅迫中的重要作用[12]。

　　MYB轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫以及激素應答方面有較多的研究。Chen等通過對擬南芥全基因組的 序 列 分 析 ，在 MYB 超 家 族 中 鑒 定 出 126 個 R2R2-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù) MYB 基因能夠響應一種或多種激素以及脅迫應答[4]。芥菜BjMYB1-3 和 BjMYB1-4 基因在擬南芥中的過表達表現(xiàn)出種子提前萌發(fā)、促進生長以及對滲透脅迫或高鹽脅迫的耐受性提高現(xiàn)象[13]。小麥 TaMYB1 基因在缺磷條件下表達量上調(diào)，過表達TaMYB1植株比野生型表現(xiàn)出更多的磷積累，提示TaMYB1在磷饑餓脅迫耐受性方面起關鍵作用[14]。過表達紫花扁豆 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 LpMYB1 轉(zhuǎn)基因擬南芥可以提高耐鹽性和耐旱性，轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢也有所提高[15]。玉米 ZmMYB30基因在脫落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、NaCl、低溫 4 種脅迫下表達水平均明顯上調(diào)，ZmMYB30轉(zhuǎn)基因擬南芥異位表達促進了植物的耐鹽性，同時非生物脅迫相關基因的表達量也有所增加，提高了植物的抗逆性[16]。

　　目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子在水稻、擬南芥等模式植物和毛竹等散生竹中研究較多，但在梁山慈竹等叢生竹中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究卻鮮見報道。梁山慈竹是我國主要經(jīng)濟竹種之一，廣泛分布于四川、云南、貴州、廣西等全國各地[17]，是一種優(yōu)良的筍材兩用竹種，具有纖維含量高且質(zhì)量好，生物量大等特點。本研究基于梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從梁山慈竹葉片中克隆得到一個 MYB 轉(zhuǎn)錄因子，命名 DfMYB3，對其進行了生物信息學分析、亞細胞定位，以及啟動子分析，為將來進一步研究梁山慈竹 DfMYB3 轉(zhuǎn)錄因子的功能提供一定的理論基礎。

　　1 材料和方法

　　1. 1 植物材料

　　梁山慈竹生長于西南科技大學生命科學與工程學院植物資源圃，葉片采集后迅速置于液氮中速凍，并于-80℃超低溫冰箱中保存。梁山慈竹當年生側枝條用于激素處理，分別用100 μmol·L-1 的赤霉素(GA)、100 μmol·L-1 的脫落酸(ABA)對梁山慈竹側枝條進行處理，以 H2O 為對照，噴灑處理 5 d，用于檢測 DfMYB3 基因的表達量變化。野生型煙草NC89無菌苗由本實驗室保存，組培室中光照16 h/黑暗8 h生長。

　　1. 2 試劑

　　RNA 提 取 試 劑 盒 Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 購自 OMEGA 公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time，Genome Walking Kit 試劑盒以及 pMD19-T 載體均購自 Ta? KaRa 公司，PCR 擴增試劑盒 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix購自NEB公司，實時熒光定量PCR試劑盒 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)SuperReal 購自天根公司。農(nóng)桿菌 EHA105菌株，DH5α大腸桿菌感受態(tài)、pART27 載體以及改造過的 pBI 載體由本實驗室保存。

　　1. 3 方法

　　1. 3. 1 DfMYB3基因克隆

　　葉片總 RNA 由 Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 試劑盒提取，之后用 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 合 成 cDNA。 用 Primer Premier 6.0 軟件設計特異性引物 DfMYB3- F/R(引物序列見表 1)。采用 NewEnglandBiolabs (NEB)公司的 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 試劑盒，擴增DfMYB3轉(zhuǎn)錄因子。PCR反應程序為98℃ 預變性 30 s，98℃變性 10 s，67℃退火 20 s，72℃延伸 40 s，30 個循環(huán)，72℃延伸 2 min。擴增產(chǎn)物與 pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化 DH5α 大腸桿菌，進行藍白斑篩選。將陽性單菌落菌液送至上海英濰捷基公司進行測序。

　　1. 3. 2 DfMYB3生物信息學分析

　　用 NCBI 在線工具 Conserved 對 DfMYB3 進行保守結構域預測分析。用 ProtParam 在線工具對 DfMYB3 基因編碼的蛋白進行分子量、理論等電點、穩(wěn)定指數(shù)、氨基酸個數(shù)等理化性質(zhì)指標的測定。用SOPMA在線工具對DfMYB3蛋白進行二級結構預測。SWISS-MODE 在線工具對 DfMYB3 蛋白進行三級結構預測。以 DfMYB3 的氨基酸序列為探針，從國家水稻數(shù)據(jù)中心、植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫、NCBI三種數(shù)據(jù)庫中獲得多條有功能的MYB序列，將氨基酸序列導入MEGA7.0篩選最適模型，采用最大似然法(Maximum Likehood)構建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap 參數(shù)為 1000)。用 PlantCARE 在線網(wǎng)站對DfMYB3啟動子序列進行元件分析。

　　1. 3. 3 實時熒光定量PCR

　　Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 試劑盒提取 GA、ABA處理后的梁山慈竹側枝條 RNA，用 Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并利用 Primer Premier6.0軟件設計 Df? MYB3 基因的 qRT-PCR 特異性引物 RT-DfMYB3-F/ R(引物序列見表1)，以Tublin作為內(nèi)參基因，Tub? lin-F/R 引物序列見表 1。用 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)SuperReal 試劑盒進行 qRT-PCR 反應，分析 DfMYB3 基因的表達量變化情況。采用 2-ΔΔCT對DfMYB3基因的相對表達量進行計算，并用 Duncan法進行差異顯著性分析。

　　1. 3. 4 DfMYB3亞細胞定位

　　用 BioEdit 軟件分析 DfMYB3 基因的所有酶切位點，用 Primer Premier6.0 軟件設計特異性引物 DfMYB3-F(KpnⅠ)和 DfMYB3-R(HindⅢ)(引物序列見表 1)，與含有綠色熒光蛋白(GFP)的 pART27 載體連接。將重組質(zhì)粒 DfMYB3-pART27 轉(zhuǎn)入水稻白化苗原生質(zhì)體中，以DAPI細胞核染色作為陽性對照，在激光共聚集顯微鏡下觀察DfMYB3融合 GFP蛋白的表達情況。

　　1. 3. 5 DfMYB3啟動子克隆

　　梁山慈竹 DfMYB3 基因序列通過與毛竹的同源 MYB 序列比對，設計 3 條同向特異的引物 SP1、 SP2、SP3(引物序列見表 1)。CTAB 法提取梁山慈竹葉片基因組 DNA，以基因組 DNA 為模板，利用染色體步移法克隆DfMYB3上游啟動子序列。Ge? nome Walking Kit 試劑盒中的 AP1、AP2、AP3、AP4 引物與設計的 3 條特異引物 SP1、SP2、SP3 進行熱不對稱PCR反應。3次巢式PCR反應后可獲得Df? MYB3基因的側翼序列。

　　1. 3. 6 DfMYB3 啟動子轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得及GUS染色

　　用 BioEdit 軟件分析 DfMYB3 啟動子的酶切位點，用 Primer Premier6.0 軟件設計特異性引物 pDf? MYB3-F(HindⅢ)和 pDfMYB3-R(XbaⅠ)(引物序列見表1)，將克隆得到的DfMYB3啟動子連接含有 GUS 報告基因的改良 pBI 載體，構建 pDfMYB3：： GUS 重組質(zhì)粒，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。提取轉(zhuǎn)基因及野生型煙草植株的DNA，進行PCR陽性驗證。陽性轉(zhuǎn)基因煙草苗在GUS染液(1 mL磷酸緩沖液， 0.1 mL TritionX-100，0.2 mL K3Fe(CN)6，0.2 mL K4Fe(CN)6，10.4 mg X-Gluc，補水定容至 10 mL)中進行組織染色，37℃培養(yǎng)箱放置過夜，然后用卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)進行脫色。

　　2 結果與分析

　　2. 1 DfMYB3基因克隆及生物信息學分析

　　基于梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以梁山慈竹葉片為材料，克隆得到一個 MYB 轉(zhuǎn)錄因子，命名為 DfMYB3。測序結果顯示，DfMYB3 基因的開放閱讀框長度為 1 287 bp(見圖 1A)，編碼 428 個氨基酸，GenBank 注冊號為 KY963358。理化性質(zhì)分析顯示，DfMYB3 的分子量為 47.33 KD，酸性殘基數(shù)大于堿性殘基數(shù)，理論等電點為 6.12。穩(wěn)定指數(shù)結果顯示，DfMYB3 編碼的是不穩(wěn)定蛋白。Df? MYB3 的脂肪族氨基酸指數(shù)為 65.00，總親水性平均系數(shù)為-0.644。保守結構域分析顯示，DfMYB3 含有兩個典型的 SANT 結構域(見圖 1B)，具有 DNA-Binding 結構域。二級結構分析顯示，Df?MYB3蛋白中無規(guī)卷曲含量最豐富，為 60.51%，其次是 31.78% 的 α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈含量最少，分別為3.97%和3.74%(見圖1C)。蛋白三級結構顯示，DfMYB3 蛋白的三維結構與 B-MYB DNA 結合域蛋白1a5j.1.A模型最為相似(見圖1D)。

　　系 統(tǒng) 進 化 樹 分 析 顯 示 ，DfMYB3 與 甘 蔗 Sc2RMyb1，毛白楊 PtoMYB216，擬南芥 AtMYB55 和 AtMYB4，以及水稻 OsMYB46 和 OsMYB103L 聚集在一起(見圖 2)，同源性較高。這些物種的 MYB 序 列 都 屬 于 典 型 的 R2R3-MYB 轉(zhuǎn) 錄 因子[18~19]，而且沒有單子葉、雙子葉植物的差異。

　　2. 2 DfMYB3亞細胞定位

　　為了研究DfMYB3蛋白的亞細胞定位情況，構建了 DfMYB3 融合綠色熒光蛋白(GFP)的重組質(zhì)粒 DfMYB3-pART27，并轉(zhuǎn)入水稻白化苗原生質(zhì)體中進行瞬時表達。以DAPI細胞核染色作為參照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達情況。結果顯示，在細胞膜以及細胞核中都檢測到了 GFP 熒光信號(見圖3)，但在細胞核中更為顯著。

　　2. 3 DfMYB3啟動子克隆及元件分析

　　以梁山慈竹基因組 DNA 為模板，利用染色體步移法克隆得到 DfMYB3 上游 2 000 bp 左右的 5′ 側翼序列。PlantCARE在線分析結果表明，該序列上含有啟動子元件TATA box、CAAT box，以及2個脫落酸(ABA)響應元件 ABRE、1 個生長素響應元件 AuxRR-core，8 個茉莉酸甲酯(MeJA)響應元件 CGTCA-motif 和 TGACG-motif，1 個赤霉素(GA)響應 元 件 GARE-motif，1 個 水 楊 酸(SA)響 應 元 件 TCA-element，2 個干旱響應元件 MBS，以及 4 個光響應元件(見表2)。

　　2. 4 DfMYB3基因?qū)A和ABA處理的響應

　　啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，DfMYB3啟動子序列上存在多個激素響應元件。為探究DfMYB3對GA及 ABA 處理的響應情況，采用實時熒光定量 PCR (qRT-PCR)檢測了 DfMYB3基因在 100 μmol·L-1 的 GA、100 μmol·L-1 的 ABA 處理下的表達量變化情況。以水為對照，分別用 100 μmol·L-1 的 GA、100 μmol·L-1 的 ABA 對梁山慈竹當年生側枝條進行噴灑處理，5 天后提取側枝條的 RNA 進行 qRT-PCR 分析。結果顯示，GA 及 ABA 處理均顯著上調(diào)了 DfMYB3 的表達。GA 處理后 DfMYB3 的表達量是對照的1.6倍，ABA處理后DfMYB3的表達量更高，達到了對照的7.6倍(見圖4)。

　　2. 5 DfMYB3啟動子的功能分析

　　為研究 DfMYB3 啟動子的活性，構建了 Df? MYB3 啟動子融合 GUS 報告基因的 pDfMYB3：： GUS 載體。通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了 12 株抗性植株。DfMYB3 啟動子序列的 PCR 分析結果表明，有9株煙草抗性苗擴增出與陽性對照一致的特異性條帶，證實 pDfMYB3：：GUS 已成功整合到煙草基因組中(見圖5)。GUS組織染色結果表明，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片的主葉脈和次葉脈中有明顯的 GUS 信號(見圖 6A)，但在莖桿中 GUS 信號較弱(見圖 6B)。對莖稈進行徒手切片后發(fā)現(xiàn)，在莖桿的表皮、皮層、維管組織以及髓細胞中均存在GUS 信號(見圖 6C~D)，表明 DfMYB3 啟動子在煙草中沒有明顯的組織特異性(見圖6)。

　　3 討論

　　MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物中，在植物的生長發(fā)育過程中起十分重要的作用。本研究克隆得到一個梁山慈竹MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為Df? MYB3。進化樹分析顯示，DfMYB3與毛白楊、擬南芥等的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子聚集在一起。MYB轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)結構域的不同可分為 4 類蛋白，其中 R2R3-MYB 是最大的一類 MYB 蛋白，廣泛參與了一系列植物生理過程，包括激素應答[20]、脅迫響應[21]、次生壁形成[22]等。轉(zhuǎn)錄因子通常定位在細胞核中[23]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，但也有轉(zhuǎn)錄因子同時定位于細胞核以及其他部位，如水稻的 ASR 蛋白同時定位于細胞核和細胞質(zhì)中[24]。丹參 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 SmMYB87 的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，SmMYB87蛋白在細胞核和細胞膜上均有分布[25]。本研究的亞細胞定位結果顯示，在細胞核以及細胞膜中均檢測到了 GFP 信號，表明 Df? MYB3蛋白在細胞核以及細胞膜中均有表達，但在細胞核中更為顯著。

　　啟動子是能夠調(diào)控基因表達的順式作用元件。藍莓VcMYB啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥能驅(qū)動GUS 基因在擬南芥中表達，并且經(jīng)ABA、低溫和光照處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中 GUS 的表達活性增強[26]。海島棉MYB轉(zhuǎn)錄因子GbMYB5基因的啟動子能夠驅(qū)動 GUS 報告基因在擬南芥的根部、葉尖部及生長點表達，推測該啟動子是一個組織特異性啟動子[27]。啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，DfMYB3啟動子序列上含有啟動子元件TATA box以及CAAT box，具有典型的啟動子特征。DfMYB3 啟動子轉(zhuǎn)基因煙草GUS 組織染色發(fā)現(xiàn)，GUS 信號在煙草葉片的葉脈以及莖桿中都被檢測到，在葉脈處最為顯著，表明 DfMYB3啟動子具有啟動子活性，能夠驅(qū)動GUS基因的表達，且DfMYB3啟動子在煙草中沒有明顯的組織特異性。

　　研 究 表 明 ，小 麥 R2R3-MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 Ta? MYB33，其啟動子序列包含 ABRE、MYB 等非生物脅迫相關元件，過表達擬南芥增強了干旱和 NaCl 脅迫的耐受性，并且提高了滲透壓平衡重建和活性氧清除能力[21]。甘蔗脅迫相關的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 ScMYBAS1 表現(xiàn)出對水分缺失和鹽脅迫的誘導反應，對啟動子 PScMYBAS1 的缺失分析表明，777 bp 或更長的啟動子片段在非生物脅迫(脫水、鹽、冷、傷)和激素(SA、MeJA)處理下，GUS 的誘導率增加了 2~4 倍[28]。巴巴多斯棉 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 GbMYB60受 ABA 以及鹽等脅迫誘導，GbMYB60 轉(zhuǎn)基因擬南芥 ABA 相關基因表達量下調(diào)，揭示了棉花 GbMYB60 基因可能通過抑制 ABA 信號來負調(diào)節(jié)植物對鹽脅迫的耐受性[29]。煙草 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 NtMYB44b經(jīng) 100 mg·L-1 GA、10 μmol·L-1 ABA 處理后，相對表達水平顯著上調(diào)，推測 Nt? MYB44b 能對上述濃度的 GA 及 ABA 處理產(chǎn)生應答[30]。金魚草 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 AmDIV 的擬南芥同源蛋白AtDIV2參與了ABA信號傳導，在外源ABA 脅迫下，AtDIV2 的表達水平顯著增加[31]。菊花 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子 CmMYB2 經(jīng)外源 ABA 處理后，菊花葉中的 CmMYB2 表達量上調(diào)[32]。本研究的qRT-PCR分析結果顯示，DfMYB3基因的相對表達量經(jīng)GA、ABA處理后均顯著上調(diào)，表明DfMYB3 基因能對 GA 及 ABA 處理產(chǎn)生應答。DfMYB3 啟動子序列上存在 MBS 干旱脅迫響應元件等，需要進一步的研究來探討 DfMYB3 是否在非生物脅迫中起作用。