海水環境下巴氏芽孢桿菌馴化及鈣質砂固化效果研究

　　摘 要：為了提升 MICP 技術在海洋環境下對鈣質砂的加固效果，在以往研究的基礎上，設計進行了人工海水環境下巴氏芽孢桿菌多梯度人工馴化培養試驗，并結合 MICP 固化鈣質砂柱的力學試驗和微細觀結構分析，對巴氏芽孢桿菌的馴化效果進行了綜合評價。結果表明：(1)海水環境下五梯度馴化后細菌的菌液濃度可達到淡水環境的 97%以上，其與膠結液作用后碳酸鹽的生成量較淡水環境下有一定幅度提高;(2)馴化后的巴氏芽孢桿菌具有很好的溫度適應能力，在 10～30 ℃溫度下均有較好的 MICP 性能;(3)海水環境下加固的鈣質砂柱無論是碳酸鹽生成量還是無側限抗壓強度均較未馴化前高，尤其是五梯度馴化后的細菌，馴化后的細菌菌體變小，在海水環境生成的碳酸鹽(碳酸鈣和碳酸鎂)晶體更小，更加致密，能更好地填充鈣質砂顆粒的孔隙并膠結相鄰的鈣質砂顆粒，具有更優異的 MICP 性能。相關研究思路和方法可為 MICP 技術在海洋環境鈣質砂地基加固方面的研究與應用提供參考。

　　關 鍵 詞：海水加固;梯度馴化;鈣質砂;巴氏芽孢桿菌;微生物誘導碳酸鹽沉積

　　肖瑤; 鄧華鋒; 李建林; 程雷; 朱文熙， 巖土力學 發表時間：2021-11-26

　　1 引 言

　　鈣質砂作為一種碳酸鈣含量極高的特殊巖土體介質，是我國南海島礁的重要組成部分。在島礁的工程建設過程中，鈣質砂地基的加固處理是一項重要的任務[1-2]，直接影響工程的長期安全。目前島礁地基土的處理方式主要有注漿法、樁基礎處理法、振沖擠密法等，這些方法在一定程度上可以改善地基土的工程特性，但島礁所處位置遠離陸地，材料運輸成本巨大[3]。若能就地利用島礁及其周圍環境的材料對地基土進行加固，將很大程度上節約經濟成本，且具有較好的環境相容性。

　　基于交叉學科的 MICP 技術近年來發展迅速，在巖土工程領域有著越來越多的研究與應用，如砂土地基加固[4-6]、地基液化防治[7-8]、污染土治理[9-10]、沙漠地區砂土抗風蝕[11-12]等，其中，基于 MICP 技術加固鈣質砂的研究也是熱點方向。目前關于鈣質砂的加固研究主要集中在淡水環境下的加固[13-16]，加固后的鈣質砂柱物理力學性能有著較大幅度的提升，其無側限抗壓強度可以達到 MPa 級別以上。近年來，為了更好地將微生物加固技術應用到鈣質砂工程中，一些學者根據鈣質砂實際賦存環境，開展一些海水條件下的加固研究。典型的如李昊等[17]模擬海水環境對鈣質砂進行固化研究，結果顯示海水試樣的無側限抗壓強度達到淡水試樣的 2.66 倍;彭劼等[18]同樣對海水環境下 MICP 技術加固鈣質砂的效果進行了研究，其結論是海水環境會抑制 MICP 過程中碳酸鈣的最終生成量，進而使得海水環境下加固的鈣質砂柱的無側限抗壓強度低于淡水環境;此外，余振興[19]、董博文[20]等利用天然海水進行微生物培養并對鈣質砂進行加固，發現天然海水使微生物的生長出現滯后期。上述學者在海水環境下對鈣質砂的加固研究表現出不同的加固效果，出現這種差異的主要原因是用于加固適用的細菌對海水環境的適應性不同所導致。目前的研究中，通常是直接采用巴氏芽孢桿菌或其他礦化細菌在海水環境下對鈣質砂進行加固，這就需要細菌在海水環境條件下能夠較好地生存繁殖，且具備良好的產脲酶能力，其本質是礦化細菌能較好的適應海水環境，但這方面的研究成果還鮮有報道。

　　利用海水環境對鈣質砂進行加固，不僅可以大幅降低海水淡化的成本，同時可以使礦化細菌更好地適應海水環境并進行 MICP 過程加固鈣質砂。因此，如何使礦化細菌在海水環境下正常的生長繁殖并使得其對鈣質砂的加固效果達到甚至超過淡水環境，是本文研究的重點。那么如何使微生物適應海水環境呢?本文擬借鑒生物學研究領域的一種方法，即微生物馴化來達到這一目的。微生物馴化，也即馴化微生物的行為，是指在細菌培養基中加入靶向環境的材料或基質，讓細菌適應并依賴靶向環境的材料或基質，從而使其在靶向環境中也能表現出較好的生長趨勢和工作特性[21-24]。為了使巴氏芽孢桿菌更好地在海水環境下進行 MICP 過程，本文采取人工馴化的方法對其進行馴化，通過制備人工海水，研究不同馴化方案對菌液濃度、碳酸鈣生成量、固化砂柱的力學性能等方面的影響，通過對比得到合適的馴化方案和馴化后的巴氏芽孢桿菌菌種，為將 MICP 技術更好地應用到海水環境下的鈣質砂加固提供參考。

　　2 海水環境下巴氏芽孢桿菌的馴化

　　2.1 海水環境下巴氏芽孢桿菌馴化方案

　　本文選取巴氏芽孢桿菌(Sporosarcina pasteurii，編號：ATCC 11859)作為進行海水環境下人工馴化培養的菌種。根據標準 ASTM D1141-98(2013)[25]中海水替代品的化學組成成分和物質含量可知，組成人工海水、含量較多的前 10 種化合物為 NaCl、MgCl2、 Na2SO4、CaCl2、KCl、NaHCO3、KBr、H3BO3、SrCl2、 NaF。上述化合物的含量如表 1 所示。按表中數據進行人工海水的配置，其鹽度為 35‰，pH 值約為 8.2。

　　根據相關微生物馴化研究的方法和思路[21-24]，本文擬采取直接馴化、三梯度馴化和五梯度馴化等 3 種馴化方案對巴氏芽孢桿菌進行海水環境的馴化研究。馴化培養基的配制方法如下：首先，根據表 1 所示的物質成分和含量配置人工海水，用去離子水等體積替代海水，制得不同濃度的人工海水;然后，在不同濃度的人工海水中，參考以往研究經驗[26-28]，分別加入蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 3 g/L、氯化鈉 5 g/L、尿素 60.06 g/L 等 4 種培養基的組成物質，制得不同海水濃度下的馴化培養基。馴化試驗方案如表 2 所示，不同的梯度馴化方案下馴化流程如圖 1 所示。

　　根據表 2 和圖 1 所示，具體的馴化流程如下：

　　(1)直接馴化：將 1 mL 巴氏芽孢桿菌加入到盛有100 mL人工海水的馴化培養基的錐形瓶A中，搖床 30 ℃、180 r/min 培養 48 h 后取出，即完成直接馴化，此時錐形瓶 A 中的細菌即為直接馴化的細菌。

　　(2)三梯度馴化：將 1 mL 巴氏芽孢桿菌加入到盛有 100 mL 1/3 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 B 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 B 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 2/3 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 C 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 C 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 D 中，培養 48 h 后取出，即完成三梯度馴化，此時錐形瓶 D 中的細菌即為三梯度馴化的細菌。

　　(3)五梯度馴化：將 1 mL 巴氏芽孢桿菌加入到盛有 100 mL 1/5 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 E 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 E 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 2/5 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 F 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 F 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 3/5 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 G 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 G 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 4/5 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 H 中，培養 48 h 后取出備用;將錐形瓶 H 中 1 mL 菌液加入到盛有 100 mL 海水濃度的馴化培養基的錐形瓶 J 中，培養 48 h 后取出，即完成五梯度馴化，此時錐形瓶 J 中的細菌即為五梯度馴化的細菌。

　　另外，在每一級海水濃度的馴化過程中，對該海水濃度下的細菌進行多次擴大培養并測量菌液濃度，直至前后 2 次培養得到的菌液濃度不再變化之后，進行下一個海水濃度的馴化過程，以三梯度馴化為例，詳細的馴化過程如圖 2 所示。

　　2.2 馴化過程中巴氏芽孢桿菌菌液濃度變化

　　為了分析馴化過程中細菌濃度的變化情況，對不同馴化方案，在每級海水濃度下的擴大培養過程中，采用分光光度計(采用 600 nm 的波長)測定菌液的吸光度，根據 OD600 值來表示菌液濃度[29-30]。 3 種馴化方案下，每一級海水濃度下細菌的初始階段和培養達到穩定階段的菌液濃度如圖 3 所示。

　　由圖 3 可知，不同馴化方案對巴氏芽孢桿菌的馴化效果明顯不同：

　　(1)直接馴化方案下，菌液濃度明顯較低，即使經過多次擴大培養，其提升幅度有限，表明高濃度的海水環境對巴氏芽孢桿菌的生長繁殖有明顯的抑制作用。

　　(2)對于三梯度和五梯度馴化方案，每一級海水濃度的馴化過程中，馴化初始階段的菌液濃度均相對較低，經過該海水濃度下的多次擴大培養后，菌液濃度迅速并逐漸趨于穩定，而且海水濃度越低，提升的幅度越明顯。

　　(3)在梯度馴化過程中，隨著海水濃度的逐級提升，馴化達到穩定階段的菌液濃度呈逐漸降低的趨勢。這是因為隨著海水濃度的提升，滲透壓力逐漸增大，隨著馴化過程的進行，雖然巴氏芽孢桿菌對滲透壓升高有一定的適應能力，但高滲透壓勢必會對細菌生長繁殖產生一定的影響，因此，每級馴化完成之后，其菌液濃度均會低于上一級海水濃度下的菌液濃度。

　　(4)三梯度和五梯度馴化完成后，菌液濃度分別為 0.612 和 0.652，可以達到淡水環境下相當的水平，說明梯度馴化下，細菌能較好地逐步適應海水環境。

　　2.3 馴化過程中巴氏芽孢桿菌誘導生成碳酸鹽產量變化

　　De Muynck 等[31]、彭劼等[32]研究發現溫度對巴氏芽孢桿菌的生長趨勢和 MICP 性能影響較大，在 10～ 37 ℃范圍左右尤為明顯。在試驗過程中，為探討溫度對馴化后巴氏芽孢桿菌 MICP 性能的影響，考慮海水溫度條件，試驗中考慮了 10 ℃和 30 ℃兩種情況。對不同馴化培養方案下 MICP 作用后碳酸鹽的生成量進行測定，具體流程如下：

　　(1)對不同海水濃度馴化培養方案下的細菌進行擴大培養，180 r/min、48 h 后取出備用[33]。

　　(2)分別取不同馴化培養方案下的菌液各100 mL，加入到盛有 0.5 mol/L 300 mL 膠結液(充足的膠結液，1.0 mol/L CaCl2 溶液和 1.0 mol/L 尿素溶液等體積混合)的錐形瓶中充分混合，置于 10 ℃或 30 ℃ 的電熱恒溫保溫箱中保溫 48 h，使得菌液與膠結液充分反應。

　　(3)48 h 后取出錐形瓶，將錐形瓶中生成的碳酸鹽倒入培養皿中，烘干后稱取碳酸鹽生成量。

　　不同馴化方案下碳酸鹽生成量如圖 4 所示，由圖可以看出：

　　(1)直接馴化方案中，兩種溫度條件下碳酸鈣生成量較馴化前(即未馴化的巴氏芽孢桿菌在淡水環境下的 MICP，后文統一簡稱馴化前)大幅度降低，僅占馴化前碳酸鈣生成量的 2.62%～3.92%，說明巴氏芽孢桿菌對海水環境適應能力較差，MICP 過程受到了明顯的抑制，這與彭劼等[18]得到的試驗規律是一致的。三梯度馴化后，碳酸鈣的生成量較馴化前增加了 6.68%～16.82%，五梯度馴化后，碳酸鈣的生成量較馴化前增加了 12.59%～22.79%，說明梯度馴化過程下，巴氏芽孢桿菌對海水的適應能力逐漸增強，而且由于海水中的鈣離子、鎂離子可以提供更多的鈣源/鎂源，使得碳酸鹽的生成量較淡水環境下有一定幅度的提高。

　　(2)比較兩種溫度條件下的碳酸鈣生成量可以發現，馴化前，10 ℃和 30 ℃碳酸鹽生成量差別為 7.75%，這與以往研究得到的溫度對 MICP 的影響規律是一致的[32]。三梯度和五梯度馴化后，10 ℃ 和 30 ℃碳酸鹽生成量的差別逐漸減小為 1.64%、 1.21%，說明梯度馴化之后，溫度對 MICP 的影響明顯減弱。也即，馴化之后的細菌不僅能適應海水環境，而且具有更好的溫度適應性。

　　3 海水馴化巴氏芽孢桿菌對鈣質砂的加固效果研究

　　3.1 鈣質砂的物理特性

　　試驗所用鈣質砂顆粒密度約為 2.70～2.85 g/cm3，過篩前的鈣質砂如圖 5 所示。為優化加固效果，使用土工標準篩對其進行篩分，按照不同的粒徑和比例進行配制，本試驗所采用的鈣質砂顆粒分布曲線如圖 6 所示。在對鈣質砂進行加固前，依次采用 0.1 mol/L 的 HCl 溶液和 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液分別對其浸泡 12 h，進行前處理[34]，浸泡結束后用去離子水清洗并烘干備用。

　　3.2 馴化巴氏芽孢桿菌對鈣質砂加固效果試驗研究方案

　　根據巴氏芽孢桿菌的馴化試驗結果，直接馴化方案下菌液濃度過低，因此，本節的砂柱加固試驗中僅考慮采用三梯度和五梯度馴化完成后的巴氏芽孢桿菌，分析研究兩種梯度馴化細菌在海水環境對鈣質砂的加固效果。另外作為對照，采用未馴化的巴氏芽孢桿菌進行鈣質砂在淡水環境下的加固，具體試驗方案如表 3 所示。

　　鈣質砂的加固采用浸泡法[17]進行。具體加固流程如下：

　　(1)將鈣質砂分層裝入自制柔性多孔模具中(如圖 7 所示)，每層稍振搗密實，層與層之間進行打毛處理，試樣制備完成后，將去離子水從裝好鈣質砂試樣頂部注入，以排除鈣質砂顆粒間空氣。(2)將 80 mL 菌液注入砂樣，靜置 12 h，待菌液充分附著在鈣質砂顆粒表面。

　　(3)將 80 mL 1 mol/L CaCl2 溶液和 80 mL 1 mol/L 尿素溶液等體積混合配制成 0.5 mol/L 160 mL 膠結液(膠結液的配置根據加固方案分為人工海水配置的膠結液和去離子水配置的膠結液)，注入砂樣中，靜置 3 d 后讓廢液從模具底部流出。

　　(4)步驟(2)、(3)為 1 次加固過程，反復進行 10 次對鈣質砂進行加固處理。

　　(5)拆除模具底部固定套，將試樣倒置并重復步驟(2)、(3)，再次進行 10 次加固。

　　(6)拆除側壁模具，將試樣放入烘箱中 60 ℃ 烘干至恒重再進行后續相關的宏觀物理力學試驗及微觀測試研究。

　　膠結完成后典型的鈣質砂柱如圖 8 所示。首先對固化好的鈣質砂柱采用加固前后質量差法對碳酸鹽的含量進行測試。然后將鈣質砂柱端部打磨平整， 采用 RMT-150C 巖石力學試驗系統對試樣進行無側限抗壓強度試驗，加載速率為 0.01 mm/s，直至試樣破壞。

　　3.3 海水馴化芽孢桿菌對膠結鈣質砂柱力學性能的影響

　　3.3.1 不同方案下鈣質砂柱中碳酸鹽含量

　　相關研究表明，當碳酸鈣生成量高于 60 kg/m3 時，砂柱的強度會得到顯著提高[35]，因此碳酸鈣的生成量可用來評價膠結效果好壞。普通硅質砂固化體中沉積的碳酸鈣通常采用酸洗的方法進行測量[36]，但鈣質砂本身的碳酸鈣含量較高，故不宜采用酸洗法，因此，本文采用加固前后鈣質砂柱的質量差作為生成碳酸鹽的質量，不同加固方案下鈣質砂柱中碳酸鹽含量如圖 9 所示。

　　由圖 9 可以看出：

　　(1)海水環境下，三梯度或五梯度馴化后的巴氏芽孢桿菌加固的鈣質砂柱中碳酸鹽的生成量均超過 18%(由 60 kg/m3 經計算轉化而來)，表明鈣質砂柱的強度得到了顯著的提高。

　　(2)海水環境下加固鈣質砂柱中碳酸鹽含量高于淡水環境，與對照組相比，三梯度馴化組和五梯度馴化組砂柱中碳酸鹽生成量分別高 19.67%和 25.86%，比較而言，五梯度馴化后細菌產生的碳酸鹽更多。與文獻[20]相比，在海水配置的膠結液濃度為 0.5 mol/L 時，砂柱中碳酸鹽生成量最多為 14%，本文相同的膠結液濃度下碳酸鹽含量均在 20%以上，表明馴化后的細菌能更好的適應海水環境，從而生成更多具有膠結作用的碳酸鹽。

　　3.3.2 不同方案下鈣質砂柱無側限抗壓強度

　　不同方案下砂柱破壞形態如圖 10 所示。圖 10 顯示不同方案下砂柱破壞模式基本一致，均有一條從頂部擴展的主裂紋及若干小裂紋，沒有局部破壞情況，表明試樣均勻性較好。

　　不同方案下鈣質砂柱典型的無側限抗壓強度曲線如圖 11 所示。

　　由圖 11 可以看出，不同方案下鈣質砂柱的軸向變形-無側限抗壓強度曲線走勢基本一致，曲線在達到峰值強度之前近似呈直線上升，達到峰值強度之后強度逐漸降低，表現出明顯的屈服階段和峰后軟化階段。馴化前鈣質砂柱無側限抗壓強度平均值為 2.57 MPa，三梯度馴化后強度提高了 20.86%～36.78%，五梯度馴化后強度提高了 38.17%～58.19%，其中，五梯度馴化組鈣質砂柱的無側限抗壓強度達到了 4 MPa。

　　無側限抗壓強度與碳酸鹽的生成量具有一致性，碳酸鹽生成量越高，對鈣質砂柱顆粒間的孔隙和鈣質砂本身的孔隙填充、對砂顆粒間的膠結作用更好，固化效果更好，砂柱的均勻性更高，因而砂柱的強度更高。文獻[17]中利用巴氏芽孢桿菌在模擬海水環境下固化鈣質砂，砂柱的無側限抗壓強度最大約為 1.75 MPa。本文試驗砂柱的無側限抗壓強度更高，表明馴化后的巴氏芽孢桿菌對鈣質砂的固化效果更好。

　　4 海水馴化巴氏芽孢桿菌加固鈣質砂機制

　　為了分析馴化過程對 MICP 加固效果的影響機制，特對不同加固方案下鈣質砂柱進行 SEM 電鏡掃描和 EDS 能譜測試。以對照組和五梯度馴化為例，取無側限抗壓試驗破壞后的試塊進行 SEM 掃描分析，分別放大 100 倍和 500 倍的 SEM 照片如圖 12 所示，相應 EDS 能譜圖如圖 13 所示。

　　結合圖 12、13 可以看出，采用未馴化的巴氏芽孢桿菌在淡水環境下對鈣質砂加固后，生成物元素組成為 Ca、O 和 C，即表明生成物主要為碳酸鈣。較多的碳酸鈣“生長”并填充在鈣質砂顆粒之間的空隙處，而且聚集堆積的碳酸鈣晶體較大，同時，鈣質砂顆粒表面的孔隙也被生成的碳酸鈣逐漸封堵。五梯度馴化后的巴氏芽孢桿菌在海水環境下對鈣質砂加固后，生成物的元素組成不僅有 Ca、O 和 C，還有 Mg 和 Cl(有 Cl 可能是因為生成物表面附著有海水)，表明生成物至少有碳酸鈣和碳酸鎂兩種碳酸鹽。孫瀟昊等[37]研究表明，碳酸鎂固化成型的固化體強度高于碳酸鈣固化體，這也是海水環境下加固鈣質砂柱的無側限抗壓強度高于淡水固化的原因之一。

　　另外一個明顯的現象是，采用馴化后的巴氏芽孢桿菌對鈣質砂進行加固時，顆粒空隙內生成的碳酸鹽晶體較小，顆粒間膠結情況更加緊密，顆粒表面孔隙被封堵的效果更好。采用光學顯微鏡對馴化前、后的菌體進觀察(如圖 14 所示)，發現馴化后的菌體與馴化前相比明顯減小，這也是造成生成的碳酸鹽礦物晶體小而致密的原因。

　　總體來說，馴化后的巴氏芽孢桿菌在人工海水環境下對鈣質砂加固的影響機制主要表現在以下 3 個方面：①梯度馴化可以使細菌逐步適應海水環境，保持較好的生長繁殖能力，分泌具有較高活性的脲酶進行 MICP 作用;②由于膠結液中含有 Ca2+和Mg2+等，在加固過程中使得細菌誘導產生 CaCO3 和 MgCO3 沉淀，在這兩種碳酸鹽作用下鈣質砂柱得到很好的固化;③馴化后的巴氏芽孢桿菌菌體形態明顯減小，使得在 MICP 過程中形成更小、更為致密的碳酸鹽礦物晶體。在上述 3 個方面的共同作用下，松散的鈣質砂膠結形成砂柱，其無側限抗壓強度較淡水環境中加固的鈣質砂柱有明顯提高。

　　5 結 論

　　本文采用人工馴化的方式對巴氏芽孢桿菌進行海水環境下的馴化，通過系列試驗研究了馴化細菌對鈣質砂加固效果。主要結論如下：

　　(1)對比直接馴化、三梯度馴化和五梯度馴化等 3 種方案發現，海水環境會抑制細菌的生成及其脲酶的合成，采用梯度馴化可以使細菌逐步適應海水環境，而且具有更好的溫度適應性。比較而言，五梯度馴化后的細菌較三梯度馴化后的細菌更具優勢，其菌液濃度可達到馴化前的 97%以上，不同溫度下碳酸鹽生成量較馴化前提升了12.59%～22.79%。

　　(2)三梯度和五梯度馴化組鈣質砂柱的無側限抗壓強度分別最高可達約 3.5MPa 和 4.0MPa，較淡水環境下分別提高了 20.86%～36.78%和 38.17%～ 58.19%，說明巴氏芽孢桿菌的梯度馴化方法是可行的，馴化后的巴氏芽孢桿菌可以有效地提升鈣質砂的加固效果，而且梯度馴化的影響也非常明顯。

　　(3)梯度馴化后的巴氏芽孢桿菌菌體形態明顯減小，具有良好的海水環境適應性。同時，海水環境能夠為 MICP 作用提供更多的鈣離子和鎂離子，進而促進了膠結固化過程中碳酸鹽的生成，提高了固化砂柱的強度。