大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤的改良研究

　　摘要：為研究濱海鹽堿土區林地栽培大球蓋菇出菇后，剩余的栽培基質(菌渣)就地還田對濱海鹽堿土區林地土壤的改良效果，選用 3 種不同含鹽量的林地栽培大球蓋菇，將出菇后的菌渣就地混翻于 0~20 cm 土層鹽堿土壤中，自然降解 4 個月后，測定試驗林地土壤理化性質、養分含量及土壤真菌群落結構。結果表明：施入大球蓋菇菌渣后，3 種濱海鹽堿土區林地土壤的 EC 值、含鹽量及容重均顯著降低;土壤孔隙度、水穩性團聚體、有機質、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;3 個處理樣地真菌群落的 β 多樣性變化明顯，強度鹽化處理樣地(Z2s)土壤真菌群落的 α 多樣性顯著提高。環境因子關聯分析表明，濱海鹽堿土區林地理化性質與土壤真菌群落分布顯著相關。本研究結果表明施入大球蓋菇菌渣能有效降低濱海鹽堿土區林地的土壤含鹽量，優化土壤理化性質，改善土壤真菌群落結構，改良效果顯著。

　　關鍵詞：大球蓋菇菌渣;鹽堿土改良;土壤理化性狀;土壤真菌群落

　　齊廣耀; 張書菡; 孫建平; 劉雅輝; 蘇斌; 呂騏羽; 姜淑霞 山東農業科學 2022-01-10

　　我國濱海鹽堿土總面積達 500 萬 hm2，多年來主要采取一些物理措施整土、覆蓋、深耕、添加磷石膏、沸石粉及井溝渠灌等措施，來改變鹽堿地的土壤結構，降低其含鹽量[1]，這些措施達到了一定的改良效果。但物理措施和水利工程方法需較大的工程量和較高的投資成本，化學手段存在二次污染等問題。而食用菌栽培過程中，出菇后剩余的栽培基質又稱為菌渣，具有容重小、通氣性好，富含大量纖維素、菌絲蛋白等有機質和多種微生物及酶等其他活性物質的特性[2，3]。國內外的研究發現菌渣對改良土壤理化性狀，增加土壤養分含量, 改良土壤微生物群落結構, 促進植物營養吸收都有著積極作用[4-7]。大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)是近年來我國新興起栽培的一種珍稀食用菌品種，可在田間、林下、大棚等地進行栽培，其栽培模式主要以各種農林廢棄物為原料，通過堆積發酵、鋪料、播種進行栽培生產，岀菇后殘余的大量栽培基質(菌渣)可以就地還田，有改良土壤的作用。本實驗室前期研究表明大球蓋菇在林地栽培出菇后，菌渣就地還田對林地土壤有較好的土壤改良效果[8]。然而菌渣還田對濱海鹽堿土的影響研究尚未見相關報道。本試驗擬通過探究 3 種不同含鹽量濱海鹽堿土區林地栽培大球蓋菇出菇后，菌渣就地還田對鹽堿土壤理化性質、養分含量以及真菌群落的影響，以期為大球蓋菇在鹽堿地的栽培及其菌渣還田改良鹽堿地技術的推廣提供理論參考。

　　1 材料與方法 1.1 試驗地概況及材料

　　試驗地位于山東省林業科學研究院東營分院(E118°41'33",N37°24'35")栽植的白蠟林下，樹齡 6 年，株行距 3 m×4 m，郁閉度 0.7，土壤類型為中度～強度鹽化土，為典型的濱海林地鹽堿土(含鹽量 2‰～6‰)，土壤性狀背景值見表 1。當地年均氣溫 12.8℃，年均降水量 555.9 mm，年均日照時數 2 657.5 h。供試菌渣為 2018 年 10 月—2019 年 5 月在鹽堿區林下栽培大球蓋菇，出菇結束后剩余的栽培基質。基質配方為稻殼 45%、闊葉雜木屑 38%、玉米芯 10%、林地土 5%、生石灰 2%，666.7m2 栽培料施用量 6 500 ㎏。

　　1.2 試驗設計及方法

　　2019 年 6 月 3 日出菇結束后，將原栽培大球蓋菇的 3 塊鹽化程度不同的鹽堿地上的菌渣，用旋耕機就地旋耕于地下，深度 20 cm，菌渣施入量(自然干重，含部分土壤)約 20 ㎏/m2。小區面積 30 m2，每處理重復 3 次，各重復地塊之間相隔 5 m，對照組與處理組相隔 10 m，對照組只旋耕不添加菌渣。試驗處理見表 2。

　　1.3 取樣方法

　　菌渣施入土壤自然降解 4 個月后，用環刀法取土樣用于測定土壤物理指標;通過“五點法”采集 0~20 cm 土層土壤，上下層土混勻，“四分法”留取土樣，之后立即過 2 mm 網篩，裝入已消毒的密封塑料袋中，液氮保存帶回試驗室，一半用于測定土壤微生物指標，一半風干用于測定土壤理化指標。

　　1.4 土壤理化性質的測定

　　土壤容重用環刀法測定，孔隙度(%)=(1-容重/土粒密度)×100，pH 值采用 pHS-2C 型數字酸度計測定，電導率(EC 5:1)采用 DDS-11A 型電導儀測定，土壤水穩團聚體采用濕篩法測定，有機質含量采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定，堿解氮采用擴散吸收法測定，有效磷采用 NaHCO3 浸提-鉬銻抗比色法測定，土壤含鹽量(‰)使用電導率法測定[9]。

　　1.5 土壤真菌高通量的測定

　　1.5.1 土壤微生物 DNA 提取、測序、處理 采用 CTAB 方法[10]對所采樣本的基因組 DNA 進行提 取 。 以 稀 釋 后 的 基 因 組 DNA 為 模 板 ， 使 用 帶 Barcode 的 特 異 引 物 ITS5-1737F (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)/ITS2-2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，以及高保真酶擴增 ITS1 區域。PCR 反應程序為：94℃預變性 5 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s，30 個循環，72℃延伸 7 min。 PCR 產物使用 2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對目的條帶使用 Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用 TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，文庫經過 Qubit 和 Q-PCR 定量，使用 HiSeq2500 PE250 進行上機測序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。根據 Barcode 序列和 PCR 擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去 Barcode 和引物序列后使用 FLASH 對每個樣品的 reads 進行拼接，得到的拼接序列為原始 Tags 數據(Raw Tags);拼接得到的 Raw Tags，參照 Qiime 的 Tags 質量控制流程，經過嚴格的過濾處理得到高質量的 Tags 數據(Clean Tags)[11，12]。經過以上處理后得到的 Tags 序列通過 UCHIME Algorithm 與數據庫 Gold database 進行比對，檢測并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)[13，14]。

　　1.5.2 OTU 聚類和物種注釋 利用 Uparse 軟件[15]對所有樣品的全部 Effective Tags 進行聚類，默認以 97%的一致性(Identity)將序列聚類成為 OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時選取 OTUs 中出現頻數最高的序列作為代表序列。用 SSUrRNA 數據庫[16] 對代表序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用 PyNAST 軟件[17]與 GreenGene 數據庫中的 "Core Set" 數據信息進行快速多序列比對，得到所有 OTUs 代表序列的系統發生關系。最后以 reads 數最少的樣品為標準對各樣品的數據進行均一化處理，后續的 Alpha 多樣性分析和 Beta 多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

　　1.6 數據處理

　　土壤性質數據及微生物相對豐富度數據采用 Microsoft Excel 2010 進行處理和圖表繪制;應用 IBM SPSS 21.0 中的 Duncan’s 法進行單因素方差分析。使用 Qiime 軟件(Version 1.7.0)計算土壤 Observed-species、Shannon-Wiener index、Simpson index、Chao1 指數;使用 R 軟件進行 Alpha Diversity、Beta Diversity 分析。

　　2 結果與分析 2.1 大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤理化性質的影響

　　2.1.1 對土壤物理性質的影響 由表 3 看出，與對照組(CK)相比，施入大球蓋菇菌渣的各處理土壤容重顯著降低，土壤孔隙度、水穩性團聚體顯著增加; M1s、Z1s、Z2s 處理土壤容重分別降低 34.07%、46.58%、48.48%，土壤孔隙度分別增加 28.78%、52.90%、52.50%，水穩性團聚體分別增加 58.54%、111.33%、123.82%。各處理組(S)間差異不顯著，對照組(CK)間， M1ck 組的土壤容重、土壤孔隙度與 Z1ck、Z2ck 組間有顯著差異，M1ck 組的水穩性團聚體與 Z2ck 組間有顯著差異。結果表明，施入大球蓋菇菌渣后改善了濱海鹽堿土區林地的物理性質。

　　2.1.2 對土壤化學性質和養分的影響 由表 4 看出，與各對照組(CK)相比，施加大球蓋菇菌渣的各處理組土壤 EC 值、含鹽量均顯著降低，土壤 EC 值分別降低 40.43%、83.03%、88.98%，含鹽量分別降低 45.45%、85.34%、90.42%;各處理組間的 EC 值、含鹽量差異不顯著，各對照組間的差異顯著。各處理組土壤有機質、速效磷、堿解氮均顯著提高，土壤有機質分別提高 87.15%、 138.50%、238.90%，速效磷分別提高 401.33%、642.28%、965.80%，堿解氮分別提高 79.86%、179.57%、 269.89%。各處理組間有機質、速效磷、堿解氮差異不顯著，各對照組間的差異顯著(Z1ck 與 Z2ck 速效磷除外)。

　　2.2 大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤真菌群落的影響

　　2.2.1 對土壤真菌的群落分布特征的影響 圖 1 表明，各組得到有效序列(effective tags)均超過 55 000 個，OTUs 數目在 400～800 之間。各組真菌的相對豐富度在門水平上差異較大。與其他組相比，M1ck 組的球囊菌門 Glomeromycota(0.17%)，M1s 組的單毛壺菌門 Monoblepharomycota (0.04%)，Z1ck 組的優被孢霉門 Mortierellomycota(13.94%)、捕蟲霉門 Zoopagomycota(0.002%)， Z1s 組的羅茲菌門 Rozellomycota(1.30%)、擔子菌門 Basidiomycota(37.23%)、毛霉菌門 Mucoromycota(0.003%)，Z2ck 組的壺門菌 Chytridiomycota(1.57%)、芽枝霉門 Blastocladiomycota (5.19%)，Z2s組的梳霉門Kickxellomycota(0.002%)、新麗鞭毛菌門Neocallimastigomycota(0.003%)的相對豐富度最高。

　　如圖 2 所示，除 Z1s 處理組外，各組的最優勢真菌群落是子囊菌門 Ascomycota(>35%)， Z1s 處理組的最優勢真菌群落擔子菌門 Basidiomycota(37.23%);與各對照組(CK)相比，各處理組的子囊菌門 Ascomycota 相對豐富度菌以及 top10 真菌群落的相對豐富度之和均顯著降低， M1s、Z1s、Z2s 處理組的子囊菌門 Ascomycota 的相對豐富度分別降低 33.87%、70.23%、29.18%， top10 真菌群落的相對豐富度之和分別降低 34.09%、27.06%、30.29%。結果表明，施加大球蓋菇菌渣顯著降低了濱海鹽堿地的子囊菌門及 top10 真菌群落的相對豐富度。

　　2.2.2 對土壤功能真菌豐富度的影響 如表 5 所示，鹽堿土區林地土壤中具有解磷功能的真菌有青霉屬 Penicillium、曲霉屬 Aspergillus、鐮刀菌屬 Fusarium，具有解鉀功能的真菌有黑曲霉 Aspergillus niger，具有生防功能的真菌有木霉菌屬 Trichoderma、節叢孢屬 Arthrobotrys，林木病原真菌有尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum。與對照組相比，M1s 處理組的 Penicillium、Fusarium、 Aspergillus niger、Fusarium oxysporum 相對豐富度顯著降低，Trichoderma、Arthrobotrys 相對豐富度顯著增加，Z1s 處理組的 Aspergillus、Fusarium、Fusarium oxysporum 相對豐富度顯著降低，Z2s 處理組的 Penicillium、Trichoderma 相對豐富度顯著增加。結果表明，施入大球蓋菇菌渣后，鹽堿土區林地土壤功能真菌豐富度變化顯著，中度鹽化地(M1s)的木霉菌屬、節叢孢屬分別增加 604.11%、236.36%;強度鹽化地(Z2s)的青霉屬、木霉菌屬分別增加 874.55%、218.10%，其原因同上述;中度鹽化地(M1s)、強度鹽化地(Z1s)的尖孢鐮刀菌分別降低 80.43%、74.44%， Fusarium oxysporum 為林木病原菌，其減少后有利于樹木健康生長。

　　2.2.3 對土壤真菌 Alpha 多樣性的影響 如表 6 所示，與對照組(CK)相比，施入大球蓋菇菌渣的 Z2s 處理組土壤真菌的物種數(Observed species)、豐富度指數(Chao1)、菌群多樣性指數(Shannon-Wiener 與 Simpson)均顯著增加，M1s、Z1s 處理組的各指標變化不顯著(Z1s 處理的 Simpson 除外)。

　　2.2.4 對土壤真菌 Beta 多樣性的影響 如圖 3 所示，各處理組與各對照組在 MDS1 軸上明顯分開。在 MDS2 軸上，3 個對照組也可明顯分開，但是 3 個處理組聚集在一起。說明施入大球蓋菇菌渣后，不同濱海鹽堿土區林地的真菌群落結構(Beta 多樣性)顯著改變，且處理組的真菌群落分布特征趨于一致。

　　2.2.5 環境因子關聯分析 由圖 4 看出，X 軸(CCA1)為第一主成分;Y 軸(CCA2)為第二主成分;環境因子與處理組(M1s、Z1s、Z2s)的相關性大小排序為，孔隙度(porosity)>有機質(organic)>水穩性團聚體(aggregate)>pH 值>含鹽量(salinity)，表明孔隙度是影響處理組土壤真菌群落結構差異的最大因素。含鹽量、水穩性團聚體、有機質和孔隙度在 X 軸上的投影長度均明顯大于在 Y 軸上的投影長度，表明這 4 個變量主要影響對照組和處理組之間的真菌群落構成。含鹽量、pH 值、有機質、水穩性團聚體、孔隙度與真菌群落組成的相關系數和 P 值分別為(0.8970，0.0005)、(0.537，0.0070)、(0.9700，0.0005)、(0. 9214，0.0005)、(0.9532，0.0005)，均達到顯著水平(P<0.05)。結果表明，濱海鹽堿土區林地土壤含鹽量、pH 值等理化性質與土壤真菌的群落結構顯著相關。

　　3 討論與結論

　　大球蓋菇菌渣含有大量有機質和多種微生物及酶等其他活性物質，將其就地翻混于林地鹽堿土 4 個月后，土壤容重降低 34.07%～48.48%，土壤孔隙度增加 28.78%～52.90%，水穩性團聚體增加 58.54%～123.82%，含鹽量降低 45.45%～90.42%，有機質增加 87.15%～ 238.90%，速效磷增加 401.33%～965.80%，堿解氮增加 79.86%～269.89%。這與謝修鴻等[18] 關于姬松茸菌糠改良蘇打鹽堿土的研究，陳世昌等[19]關于平菇菌渣改良普通耕作土的研究，以及胡留杰等[20]關于杏鮑菇等其他菌渣改良普通耕作土的研究結果較為相似，不同之處為本研究是出菇后就地還田，不需要將菌渣粉碎和二次發酵，其改良成本低，改良效果更為顯著。施加大球蓋菇菌渣后，濱海鹽堿土區林地土壤微生物中的子囊菌門 Ascomycota 及 top10真菌群落的相對豐富度顯著降低;中度鹽化地(M1s)的木霉菌屬、節叢孢屬分別增加 604.11%、236.36%;強度鹽化地(Z2s)的青霉屬、木霉菌屬分別增加 874.55%、218.10%;中度鹽化地(M1s)、強度鹽化地(Z1s)的尖孢鐮刀菌分別降低 80.43%、74.44%。這可能由于外源營養物質施入土壤后，為真菌微生物提供了大量的營養物質，從而改變真菌微生物的群落豐富度所致[21]。微生物群落結構可反映微生物競爭和協作等相互關系，群落結構影響微生物群落的功能和變化，從而導致土壤理化性質的改變[22,23]。本研究對濱海鹽堿土壤真菌群落 Beta 多樣性分析表明，菌渣對土壤真菌的群落結構改變顯著。濱海鹽堿地土壤微生物群落與環境因子的關聯分析結果表明，土壤真菌的群落結構與土壤孔隙度、有機質等理化性質顯著相關，這與陳莉莉等[24]關于土壤微生物群落與土壤理化性質的相關性結果較為一致。但本研究表明，鹽堿土區林地土壤真菌微生物群落的豐富度變化幅度更大，分析原因為大球蓋菇林地栽培特點是栽培基質數量大，菌渣還田 4 個月測量數據時，剩余的菌絲和菌渣還未完全降解，之后隨著菌渣降解時間的延長，土壤群落豐富度變化趨勢會相對穩定，本實驗室前期研究已經得到驗證[8]。

　　大球蓋菇在林地栽培出菇后，出菇畦面上仍有約 20 kg/m2 的菌渣留在土壤中，菌渣剩余量大，就地翻混還田改良土壤成本低。本試驗表明：濱海鹽堿土施加大球蓋菇菌渣后，土壤 EC 值、含鹽量及土壤容重均顯著降低;土壤孔隙度、有機質、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;土壤中子囊菌門 Ascomycota 及 top10 真菌群落的相對豐富度顯著降低;強度鹽化地(Z2s)土壤真菌群落豐富度顯著提高，Alpha 多樣性顯著提高;鹽堿地土壤真菌群落的 Beta 多樣性顯著改變;鹽堿地理化性質與土壤真菌群落結構顯著相關。本研究結果為濱海鹽堿土的改良探討了一條新的有效途徑。