FaRALF1基因調控‘紅顏’草莓果實成熟的功能分析

　　摘要多肽信號廣泛存在于高等植物體內，并對植物的生長發育和果實成熟起重要的調控作用，為探究多肽信號調控植物果實成熟機制，本研究以八倍體‘紅顏’草莓為試驗材料，通過生物信息學技術在草莓全基因組中鑒定出一類植物多肽信號家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，并根據染色體上的定位命名將其為FaRALF1-FaRALF9，通過分析FaRALFs基因家族成員在草莓果實不同發育時期的表達差異，以及其對脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、油菜素內酯(BR)、蔗糖處理(Suc)的響應特征分析，初步推測家族成員FaRALF1可能參與調控草莓果實成熟。通過構建FaRALF1基因的超表達FaRALF1-OE(OverExpression)和RNA干擾FaRALF1-RNAi(RNAinterference)載體瞬時侵染大綠時期的草莓果實，通過體視熒光顯微鏡觀察侵染5d后草莓果實的熒光標簽和成熟表型，并通過qRT-PCR(Quantitativereal-timePCR)分析基因表達量，其中FaRALF1-OE促進草莓果實成熟;相反，FaRALF1-RNAi抑制果實成熟。本研究初步表明植物多肽信號家族成員FaRALF1基因參與調控‘紅顏’草莓果實成熟，且表達量與果實成熟程度呈正相關，為研究植物多肽信號調控果實成熟機理提供了基礎。

　　本文源自分子植物育種 發表時間：2021-03-18《分子植物育種》(雙月刊)創刊于2003年，由海南省生物工程協會主辦。是一份為轉基因育種、分子標記輔助育種及常規育種服務的國際化科學期刊，內容涉及了水稻、小麥、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯類、果樹、蔬菜、花卉、茶葉、林草等多方面，主要是刊登分子遺傳育種理論、分子育種方法、分子育種研究動態以及優良種質培育的科學論文報道。主要欄目：專題評述、研究論文、研究報告、專題介紹、論文簡報、新基因、新種質、新品種、新思路、新技術、新方法、術論壇與信息。

　　關鍵詞草莓;快速堿化因子;果實成熟

　　植物自身代謝產生了多種植物激素和多肽信號，這些信號分子形成的網絡協同調控植物的各種生理活動(Pearceetal.,2001;VanstraelenandBenková,2012;HirakawaandSawa,2019)。目前已研究較深入的植物激素主要包括生長素(Auxins)、細胞分裂素(Cytokinins)、赤霉素(gibberellin,GA)、脫落酸(abscisicacid,ABA)、乙烯(Ethylene)等，但多肽信號分子的發現至今僅有30年，其對于植物生長發育和果實成熟的研究較少且很多相關的分子機制尚不清晰。多肽信號分子主要包括Systemin、ENOD40(EARLYNODULIN40)、PSK(Phytosulfokine)、CLV3(CLAVATA3)、SP11/SCR(S-locusprotein11/S-locuscysteine-richprotein)和RALF等六類(VanstraelenandBenková,2012)。其中，RALF是植物多肽超級大家族中的一個亞家族，在植物中廣泛存在，已經在51種植物中得到鑒定(CampbellandTurner,2017)，其廣泛分布在植物的營養和生殖器官，包括根、莖、葉、種子和花粉管等參與多種不同的生理活動調控(MurphyandDeSmet,2014)，主要包括細胞膨大(Harutaetal.,2014)、側根發育(MurphyandDeSmet,2014)、根毛生長(Wuetal.,2007)和花粉管伸長與受精(Geetal.,2017)等。RALF家族包含了大量成員(Sharmaetal.,2016)，但只有極少數RALF成員被鑒定出來，而對RALF信號系統核心元件的鑒定和功能研究更是少之又少。目前，只有擬南芥AtRLK1L家族的3個成員FER、BUPS1和BUPS2作為RALF信號分子的受體被鑒定和證實(Harutaetal.,2014;Geetal.,2017;Du,2016)。根據已有研究，RALF信號在調控植物生長發育的功能研究中取得了一定進展，但其調控果實成熟相關的功能及機理，特別是在信號系統中起調控作用的關鍵蛋白及其作用的分子機制仍不清楚。

　　草莓作為典型的非呼吸躍變型果實，已經成為果樹分子生物學研究的模式材料(Jiaetal.,2011)。本研究在實驗室前期研究基礎上，從八倍體‘紅顏’草莓(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)鑒定出植物多肽信號家族RALF(Rapidalkalinizationfactors)，初步探究植物多肽RALF信號是否參與調控草莓果實成熟，為深入挖掘調控草莓果實發育和品質形成的基因資源奠定基礎，對于通過基因工程創制草莓新品種具有重要意義。

　　1結果與分析

　　1.1‘紅顏’草莓FaRALF家族鑒定

　　通過生物信息學技術，在草莓全基因組鑒定出9個RALF家族成員(表1)。根據在染色體的物理位置分別命名為FaRALF1-FaRALF9(圖1)，第1、6、7條染色體分別有1個家族成員，第2、3、4條染色體分別有2個家族成員，而第5條染色體沒有發現家族成員。從FaRALFs蛋白基本信息中可知，FaRALF家族成員開放閱讀框長度在102~134之間，其中FaRALF9氨基酸數最多，為134個;分子量在11287(FaRALF3)~15460kD(FaRALF9)之間;等電點在6.7~9.82之間，其中，FaRALF4為弱酸性蛋白，其余成員均為堿性蛋白;親水系數的范圍從-0.673到-0.008，其中親水性最強的為FaRALF6;不穩定指數從29.93-54.70，其中最不穩定的為家族成員為FaRALF2，而最穩定的為FaRALF7。FaRALF家族成員的理化參數的獲取為深入研究家族成員蛋白表達、純化和功能提供依據。

　　1.2草莓FaRALF家族對激素的響應特征

　　為探究FaRALF家族對果實成熟的調控功能，本研究選擇已被證實為對草莓果實成熟具有調控功能的4種激素信號物質(ABA,IAA,BR和Suc)來處理大綠時期的草莓果實。結果顯示(圖2)，RALF家族成員對激素處理響應顯著。IAA、BR和Suc處理下，RALF家族成員基因表達量明顯增加，尤其是對BR響應比較劇烈，其中，FaRALF8基因表達量是對照的13.21倍。但是，FaRALF2和FaRALF3在ABA處理下，其表達量均出現降低。因此，該結果也暗示著FaRALF家族可能參與調控草莓果實成熟。

　　1.3草莓FaRALF家族在果實不同發育時期的表達特征為研究FaRALF家族在草莓果實不同發育時期的表達特征，將草莓果實發育分成5個時期，即，小綠期(smallgreen,SG)、中綠期(mediumgreen,MG)大綠期(biggreen,BG)、轉色期(turning,TN)、全紅期(fullyred,FR)。結果顯示(圖3)，FaRALF家族基因表達量在果實成熟過程中表現出不同的變化規律。FaRALF1表達量在果實發育前期緩慢增加，轉色期后迅速增加，FaRALF4、FaRALF6、FaRALF7和FaRALF8表達量呈現出先增加后降低的趨勢，而FaRALF2、FaRALF3、FaRALF5和FaRALF9則隨著果實發育而降低，其中，FaRALF5在中綠果期后幾乎不表達，FaRALF9的表達量降低最劇烈，小綠果期的表達量是全紅期的512.1倍。這些結果可能暗示FaRALF家族成員在草莓果實成熟進程中發揮著不同的作用。

　　1.4FaRALF1調控草莓果實成熟的功能分析

　　為研究FaRALF家族調控草莓果實成熟的功能，本研究以篩選出與草莓成熟相關度最高的家族成員FaRALF1為研究對象，通過構建攜帶FaRALF1基因的干擾、過表達載體瞬時侵染草莓果實，分析果實表型及對熒光標簽進行觀察。結果顯示(圖4)，5d后在體式熒光顯微鏡下均能觀察到DsRed紅色熒光，說明FaRALF1-OE和RNAi載體均成功轉化到果實內。空載處理的對照果實部分變紅，FaRALF1-RNAi干擾處理果實只有少量變紅，而FaRALF1-OE過表達處理果實則全部變紅，表明FaRALF1-RNAi抑制草莓果實成熟，而FaRALF1-OE則促進草莓果實成熟。熒光定量PCR檢測結果進一步表明(圖5)，FaRALF1-OE過表達處理基因表達量是對照的4.11倍，而FaRALF1-RNAi干擾處理基因表達量是對照的0.15倍。以上結果說明，FaRALF1正調控草莓果實成熟。

　　2討論

　　本研究在八倍體草莓基因組鑒定出9個RALF家族成員，并根據染色體物理定位進行命名。鑒定家族成員在草莓果實不同時期表達量以及對于生物脅迫的響應程度。對FaRALF1進行過表達、RNA干擾瞬時轉化果實處理，并從表型、基因層面進行驗證，初步認為FaRALF1參與正調控草莓果實發育成熟。

　　眾所周知，不論是呼吸躍變型果實還是非呼吸躍變型果實，植物激素具有微量高效的特點，并在果實成熟過程中具有重要的調控作用。特別是ABA(Jiaetal.,2013;Liaoetal.,2018)、IAA(Fengetal.,2019)等已被證實參與果實成熟的調控過程。本研究發現RALF家族對ABA的響應與對照果實具有顯著性差異，大部分成員在ABA處理時基因表達量升高，只有FaRALF2/3在ABA處理下，表達量降低。因此，該結果也預示RALF家族可能參與調控草莓果實成熟。且擬南芥中RALF基因在不同器官中存在著不同表達譜的研究結果表明，隨著不同的發育階段以及植物受到的生物、非生物脅迫，RALF具有廣泛的表達特征(MacintoshandGreen,2001)。本研究對于生物脅迫的處理結果符合前人研究結果(圖2)：RALF家族對激素處理均表現出明顯的響應，在IAA、BR和Suc處理下相關基因的表達量明顯增加，且對BR響應尤為劇烈，其中，FaRALF8基因表達量是對照果實中的13.21倍。本實驗室在前期研究中也發現BR參與調控草莓果實早期成熟進程(Chaietal.,2013)。這表示RALF家族可能通過BR信號轉導路徑參與調控果實成熟。

　　此前有研究表明RALF家族成員可能參與草莓不同組織和器官的發育，不同的成員可能對不同發育時期的果實產生影響，特別是對于FvRALF1，FvRALF2，FvRALF5，FvRALF10和FvRALF12可能對瘦果期和花托期果實發育有影響(Zhangetal.,2020)。如圖所示，RALF家族成員在草莓果實中均有表達，并且隨著果實成熟進程表現出不同的變化規律(圖3)。RALF4/6/7/8表達量隨著果實成熟進程呈現出先增加后降低的趨勢，RALF2/3/5/9隨著果實成熟進程而降低，而FaRALF1表達量在果實發育前期緩慢增加，轉色期后迅速增加。這些結果與前人研究結果相一致，也表明FaRALF家族成員在草莓果實成熟進程中發揮著不同的作用。在此基礎上，為進一步驗證FaRALF1參與草莓果實發育成熟的功能，本研究利用瞬時轉基因技術處理八倍體‘紅顏’草莓果實。結果均能觀察到DsRed紅色熒光(圖5)，說明FaRALF1-OE和FaRALF1-RNAi載體均在成功轉入果實細胞內并在果實體內成功表達。由瞬時轉基因成功后的果實表型可以發現FaRALF1-OE促進草莓果實成熟，而FaRALF1-RNAi則抑制草莓果實成熟。以上結果表明，FaRALF1正調控草莓果實成熟。

　　模式植物和主要農作物中已經有研究表明，植物的生長發育過程是由植物分泌的多肽信號分子和非蛋白質類的信號分子共同形成的信號網絡協同調控(HirakawaandSawa,2019)。本研究結果表明(圖2)：RALF家族成員對于ABA、IAA、蔗糖等非蛋白質類信號響應敏感。盡管目前未在草莓果實的發育成熟中揭示出RALF的信號轉導通路，但有報道指出RALFs還參與調控植物響應生物脅迫和非生物脅迫應答，RALF通過其受體FERONIA發揮生物學功能，在對于受體FER的磷酸化程度上表現與ABA一致(Guptaetal.,2010;Atkinsonetal.,2013)。草莓中也鑒定出一個重要的細胞質蛋白激酶FaRIPK1，通過ABA信號轉導路徑參與調控草莓果實成熟(Houetal.,2018)。同時擬南芥中的研究表明，某些RALF成員可以和FER結合，而FER和細胞質蛋白激酶RIPK結合形成激酶復合物轉導RALF信號抑制根系生長發育(Du,2016)。盡管RALF信號調控擬南芥根系生長發育和調控草莓果實成熟的作用不同，但是RALF信號轉導的分子作用機制應該是相似的。

　　本研究在前人研究的基礎上進一步驗證了FaRALF1的功能，但并未對所鑒定的9個家族成員均進行功能載體構建以及瞬時轉化的實驗;僅對果實進行了不同時期基因表達量測定，相比而言，不同部位的時空表達測定更具有代表性;對于本研究更深入的結果分析及后續的研究仍存在一定局限性。但結合本研究與前人研究結果，該研究對于揭示多肽信號參與草莓果實發育成熟以及深入挖掘草莓成熟發育相關基因具有重要意義;針對目前人工栽培種草莓異花授粉以及易感染真菌病害的特點，多肽信號介導的調控機制對于提高栽培種草莓品質和創制新品種草莓提供了重要參考價值。

　　3材料與方法

　　3.1植物材料

　　試驗材料為北京農學院組織培養中心種植八倍體草莓‘紅顏’(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)，溫度為20℃~26℃、相對濕度為70%~90%、光照14h、黑暗10h。

　　主要試劑包括RNA提取試劑盒(OMEGA)、BP、LR反應試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)等，均購于北京華佰泰生物技術有限公司;反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、T1Simple、Trans1-T1PhageResistant感受態細胞購買與北京全式金生物技術有限公司;農桿菌GV3101感受態細胞購于北京華越洋生物技術有限公司。

　　3.2目的基因的克隆

　　將‘紅顏’草莓果實于液氮中保存，按照OMEGA試劑盒要求提取總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈，使用NEB公司Q5高保真酶進行PCR克隆目的基因，所用引物序列已列出(表2)。

　　3.3不同發育時期基因表達量測定

　　草莓果實成熟期分五個時期，即：小綠期(smallgreen,SG)中綠期(mediumgreen,MG)大綠期(biggreen,BG)、轉色期(turning,TN)和全紅期(fullyred,FR)。基因表達量分析方法參照文獻(柴葉茂等,2011)。

　　3.4載體構建

　　通過Gateway體系構建FaRALF1基因的過表達(pH7FWG2-RR-293-DsRed)及沉默載體(pK7GWIWG2(II)RR-277-DsRed)，功能載體均攜帶獨立表達的DsRed熒光標簽;引物序列見表2。具體方法參照文獻(谷曉嬌和沈元月,2020)。

　　3.5瞬時轉化

　　將構建好的載體轉化到農桿菌GV3101中，挑取單克隆菌株活化。將瞬時侵染處理后的草莓果實置于智能人工氣候箱中，溫度為25℃，相對濕度為80%，黑暗處理5d。具體方法參照文獻(王樹芳,2018)。

　　3.6激素處理

　　激素處理包括：25℃條件下：100μmol/L脫落酸(ABA)處理果實6h，500μmol/L生長素(IAA)處理果實6h，100mmol/L蔗糖(Suc)處理果實6h，100μmol/L油菜素內酯(BR)處理果實8h，對照處理(LB培養液,6h)保持在25℃和100%相對濕度。選擇大綠期的果實后處理。具體方法參照文獻(盧文靜,2018)

　　3.7FaRALF家族生物信息學分析

　　草莓RALF家族在三個公共數據庫中鑒定：國家生物技術信息中心，草莓基因組瀏覽器和PLAZA。草莓RALF家族蛋白理化參數分析通過ExPasy網站提供的工具計算推定蛋白基本信息。具體方法參照。