綠肥不同還田方式對土壤溫室氣體排放的影響

　　摘要：為探究不同綠肥在翻壓和覆蓋兩種還田方式下引起的溫室氣體排放及對土壤微生物量碳氮的影響。采用室內培養試驗，設置光葉苕子翻壓(VB)、光葉苕子覆蓋(VS)、黑麥草翻壓(RB)、黑麥草覆蓋(RS)和無綠肥(CK)5 個處理，測定土壤 CO2、N2O、CH4濃度和微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)含量，分析了土壤溫室氣體的排放速率、累積排放量以及綜合增溫潛勢。結果表明，綠肥還田顯著提高了土壤 CO2、N2O 的排放，不同還田方式(翻壓與覆蓋還田)及不同綠肥品種對 CO2、N2O 排放的影響存在顯著差異。覆蓋還田較翻壓還田顯著降低了 CO2、N2O 排放。培養期內綠肥覆蓋處理 CO2的排放速率和累積排放量比翻壓處理降低 17. 07%~18. 55% 和 8. 15%~9. 79%; N2O 的排放速率和累積排放量降低 22. 91%~38. 35% 和 17. 97%~34. 39%。在相同還田方式下，不同綠肥品種顯著 影 響 了 CO2、N2O 排 放 ，豆 科 綠 肥 還 田 引 起 的 CO2、N2O 累 積 排 放 量 比 禾 本 科 綠 肥 高 8. 87%~10. 85% 和 21. 90%~52. 42%。各處理土壤溫室氣體的排放與土壤微生物量碳、微生物量氮(MBC、MBN)含量呈顯著正相關，綠肥翻壓還田顯著提升了 MBC、MBN 含量，比覆蓋還田高 21. 42%~40. 52% 和 28. 22%~34. 23%。綜上，綠肥覆蓋還田比翻壓還田更能有效減少土壤溫室氣體的排放，且有利于保護生態環境和節約人工成本，但是對作物生長及產量的影響有待田間試驗驗證。

　　本文源自張學良; 張宇亭; 劉瑞; 謝軍; 張建偉; 徐文靜; 石孝均， 草業學報 發表時間：2021-05-20 《草業學報》雜志，于1990年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:62-1105/S，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：綜合評述、研究簡報、相關信息等。

　　關鍵詞：綠肥;還田方式;溫室氣體

　　大氣中溫室氣體濃度的增加是導致全球變暖的主要原因之一[1]，大氣中 CO2、N2O 和 CH4對溫室效應的貢獻率分別為 76. 7%、7. 9% 和 14. 3%[2]。農田土壤是溫室氣體的重要排放源，約占人類農業生產溫室氣體排放的 14%[3]。有機物料的投入、施肥及灌溉等農業管理措施會影響農田土壤溫室氣體的排放，有機物料通過改變農田土壤微生物量以及土壤物理、化學特性而影響溫室氣體的排放已有較多報道[4-5]，但是不同碳氮比有機物料在不同還田方式下對溫室氣體的排放影響研究較少。

　　綠肥是我國重要的植物源有機肥，在改良土壤、提供清潔有機肥源、提高作物產量、改善農田生態環境等方面的作用已得到廣泛認可[6]。綠肥與秸稈等其他有機物料相比具有碳氮比低、微生物分解快的特點。綠肥還田主要采用翻壓還田與覆蓋還田，我國長期以來主要采用翻壓還田為作物提供養分和改良土壤;國外主要采用覆蓋還田保持水土、改善土壤環境條件。這兩種還田方式由于其對土壤環境的影響不同，必然影響微生物對綠肥的腐解及溫室氣體的排放。關于綠肥翻壓還田對 CO2、N2O 和 CH4排放的研究較多。Sanz 等[5]研究表明，翻壓綠肥后能夠提高微生物活性，顯著刺激土壤呼吸，增加土壤 CO2和 N2O 的排放。常單娜等[7]研究發現翻壓紫云英(Astraga? lus sinicus)促進了 CO2和 CH4排放，抑制了 N2O 排放。Mancinelli 等[8]研究發現非豆科綠肥或非豆科綠肥與豆科混合翻壓對土壤 N2O 排放無顯著影響，但能顯著提高土壤 CH4的排放通量。目前關于綠肥覆蓋還田對溫室氣體排放的研究較少，尤其是不同綠肥在兩種還田方式之間對土壤溫室氣體排放的影響程度還尚不明確。因此，本研究以光葉苕子(Vicia villosa)、多年生黑麥草(Lolium perennel)兩種不同碳氮比綠肥品種為試驗材料，設置翻壓和覆蓋兩種綠肥還田方式，采用室內培養研究綠肥不同還田方式下土壤溫室氣體排放以及土壤微生物量碳氮的變化，明確翻壓和覆蓋綠肥對土壤溫室氣體排放及土壤微生物量變化的影響，旨在為綠肥不同還田方式所引起的環境效應提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1. 1 供試材料

　　供試土壤為侏羅紀沙溪廟組紫色泥巖發育而成的紫色土，土壤基本理化性質為：pH 值 7. 09，有機質 7. 07 g· kg-1 ，全氮 0. 50 g·kg-1 ，全磷 0. 88 g·kg-1 ，全鉀 25. 78 g·kg-1 ，堿解氮 52. 39 mg·kg-1 ，速效磷 74. 53 mg·kg-1 ，速效鉀 95. 33 mg·kg-1 。供試土壤取自重慶市北碚區西南大學試驗農場(30°26′N，106°26′E)，海拔 266. 3 m，屬亞熱帶濕潤季風氣候，年均降水 1115. 3 mm，年平均氣溫為 18. 3 ℃，土壤取回后置于室內風干磨細過 2 mm 篩后供培養試驗用。供試綠肥為光葉苕子和多年生黑麥草，于 2019 年 5 月 9 日采集綠肥地上部鮮樣為供試樣品，帶回實驗室立即開展試驗，供試樣品水分含量分別為 87. 52% 和 86. 84%，綠肥干樣養分含量見表 1。

　　1. 2 試驗設計

　　利用 2 種不同碳氮比的豆科和禾本科綠肥，設置翻壓、覆蓋 2 種還田利用方式，分別為光葉苕子翻壓(vetch bury，VB)、光葉苕子覆蓋(vetch surface，VS)、黑麥草翻壓(ryegrass bury，RB)、黑麥草覆蓋(ryegrass surface， RS)，同時設置一個無綠肥對照(CK)，共計 5 個處理。每個處理 24 次重復(滿足 6 次破壞性取樣的需要)。通過室內培養試驗研究不同綠肥種類及還田方式對溫室氣體排放及微生物量的影響。翻壓處理中將 7. 5 g 綠肥鮮樣與 150 g 風干土壤混合均勻(按照大田綠肥 30000 kg·hm-2 翻壓/覆蓋量計算)，裝入 500 mL 培養瓶中;覆蓋處理則先將 150 g 風干土壤裝入培養瓶中，再將 7. 5 g 綠肥鮮樣平鋪于土壤上。加入純水，調節土壤含水量在田間持水量的 65%，在 25 ℃恒溫避光密閉培養 91 d，在培養期間每隔 3 d 采用稱重法補充損失的水分，使土壤水分保持恒定狀態。分別在培養的第 1、3、5、7、14、21、35、49、70、91 天進行氣體采集，每個處理任選 4 瓶抽取氣體用于分析 CO2、 N2O 和 CH4濃度，取氣前輕搖讓氣體混勻，取完后將所有培養瓶敞口通氣 1 h，以滿足土壤好氧微生物的呼吸需要，之后密封繼續培養，下次同樣方法收集氣體。在第 3、7、14、35、49、91 天破壞性取土壤樣品，每個處理取樣 4 瓶 ，用 于 測 定 土 壤 的 微 生 物 量 碳(microbial biomass carbon，MBC)和 微 生 物 量 氮(microbial biomass nitrogen， MBN)含量。

　　1. 3 測定方法

　　氣體采集后 24 h 內采用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定 CO2、N2O 和 CH4的濃度。CO2、CH4濃度采用火焰離子化檢測器(flame ionization detector，FID)測定，N2O 濃度采用電子捕獲檢測器(electron capture detec? tor，ECD)測定。氣相色譜儀在每次測試時使用國家標準計量中心的氣體進行標定。CO2、N2O、CH4的排放速率公式為[7]： F = P × V × M × 273× 1000 22.4 × m × t ×( 273+ T ) 式中：F 為 CO2產生速率(mg·kg-1 ·d-1 )或 N2O 或 CH4產生速率(μg·kg-1 ·d-1 );P 代表室溫下氣相色譜法檢測的樣品氣體濃度(×10-6 mol·mol-1 )，V 為培養瓶內氣體所占的體積(L)，M 為 CO2摩爾質量(g·mol-1 )，t 為培養時間(d);m 為土壤樣品干重(g)，T 為培養溫度(℃)。

　　CO2、N2O、CH4累計排放量計算公式為： Ct'= Ct + Ft + Ft' 2 × (t'- t) 式中：Ct'和 Ct分別為 t'和 t時氣體累積排放量[CO(2 mg·kg-1 )，N2O(μg·kg-1 )和 CH(4 μg·kg-1 )]，Ft'和 Ft分別為 t'和 t 時氣體產生速率[CO(2 mg·kg-1 ·d-1 )，N2O(μg·kg-1 ·d-1 )和 CH(4 μg·kg-1 ·d-1 )]，t 和 t' 分別為取樣時間(d)和 t 之后一次取樣時間(d)。

　　根據最新 IPCC[9]研究成果，在 100 年時間尺度下，CH4和 N2O 的增溫潛勢分別是 CO2的 28 和 265 倍。由此，全球增溫潛勢計算公式如下： GWP = WCO2 + 28WCH4 + 265WN2O 式中：GWP(global warming potential)為增溫潛勢，表示培養期內 CO2、CH4和 N2O 排放的綜合溫室效應(g CO2 · kg-1 )，WCO2 、WCH4 和WN2O 分別為培養期內 CO2、CH4和 N2O 的排放總量。

　　采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法[10]測定土壤微生物生物量碳(MBC)、生物量氮(MBN)含量，轉換系數 KEC為 0. 38，KEN為 0. 45。

　　1. 4 數據處理

　　采用 Excel 2016 和 SPSS 20. 0 軟件進行數據整理和統計分析，采用 Origin 9. 5 作圖。

　　2 結果與分析

　　2. 1 綠肥不同還田方式對土壤溫室氣體排放速率的影響

　　在不同還田方式(翻壓、覆蓋)下，光葉苕子處理的 CO2排放速率隨培養時間的變化規律基本相似(圖 1a)，培養期間大致呈現出快速下降、緩慢下降和相對穩定的變化。但是黑麥草處理在培養開始階段還有一個急劇上升的過程，黑麥草翻壓(RB)和覆蓋(RS)在培養的前 3 d 內 CO2 排放速率快速上升，在第 3 天達到峰值，分別為 297. 69、223. 26 mg·kg-1 ·d-1 。3 d 之后各處理的 CO2排放速率急劇下降，在培養第 14 天時 CO2排放速率下降至開始時的 12. 63%~37. 38%，在 14~70 d 的培養期中，CO2排放速率緩慢下降且顯著低于前一階段，培養 35 d 之后各綠肥處理土壤 CO2排放速率基本接近;在 70 d 后 CO2排放速率進入相對穩定時期，與對照處理接近。與 CK 相比，在 91 d 培養時間內，VB、VS、RB、RS 的平均 CO2排放速率顯著增加(P<0. 05)，各處理平均 CO2排放速率從小到大的順序為 CK

　　相比 CK 處理，各綠肥處理的 N2O 排放速率均顯著提高(P<0. 05)。各處理的 N2O 排放速率在第 7 天達到最大值(圖 1b)，為 111. 79~238. 32 μg·kg-1 ·d-1 ;不同綠肥還田處理表現為 VB>RB>VS>RS，其中豆科綠肥光葉苕子翻壓處理(VB)的 N2O 排放速率顯著高于其他處理。在 7~21 d 的培養期中，N2O 排放速率隨著培養時間的延長迅速下降，在培養第 21 天時，N2O 排放速率下降至第 7 天的 29. 65%~40. 76%，在 21~91 d 的培養期中，N2O 排放速率呈階梯式下降。在整個培養期中，相比 VS、RS 和 RB 處理，VB 顯著提高了 N2O 排放速率(P<0. 05)。翻壓綠肥處理的平均 N2O 排放速率顯著高于覆蓋綠肥處理，增幅在 22. 91%~38. 35%;光葉苕子處理的平均 N2O 排放速率顯著高于黑麥草處理，增幅在 21. 90%~52. 42%。

　　在培養期間(圖 1c)，各處理的 CH4排放速率多為負值，對 CH4有微弱的吸收，表現為 CH4匯。在整個培養期中，各處理平均 CH4吸收速率從小到大的順序為 CK

　　2. 2 綠肥不同還田方式對土壤溫室氣體累計排放量的影響

　　各處理 CO2累積排放量隨培養時間不斷增加，培養前 7 d 迅速增加，之后隨培養時間延長增幅減慢漸趨平緩(圖 2a)。第 1 周的 CO2累積排放量顯著高于其余 12 周(P<0. 05)，各處理第 1 周的累積排放量占整個培養期(共計 13 周)的 32. 18%~39. 86%。 培 養 結 束 時 不 同 處 理 CO2 累 積 排 放 量 存 在 顯 著 差 異 ，4 個 綠 肥 還 田 處 理(4631. 56~6190. 98 mg·kg-1 )顯著高于 CK(1342. 57 mg·kg-1 )，分別是 CK 的 4. 61、3. 76、4. 16 和 3. 44 倍。從綠肥利用方式看，翻壓還田(VB 和 RB)處理的 CO2累積排放量顯著高于覆蓋還田(VS 和 RS)處理，翻壓比覆蓋處理高 20. 58%~22. 78%。在同種還田方式下，不同綠肥品種之間 CO2累積排放量也存在顯著差異，光葉苕子處理 CO2累積排放量顯著高于黑麥草處理，增幅為 8. 87%~10. 85%。

　　各處理 N2O 累積排放量隨培養時間延長不斷增加，培養前 14 d 各處理的 N2O 累計排放量占整個培養期間的 34. 57%~45. 69%。整個培養期內，各綠肥處理的 N2O 累積排放量顯著高于 CK，不同綠肥處理的 N2O 累積排放量的高低順序依次為：VB>RB>VS>RS。同種還田方式下，光葉苕子處理的 N2O 累積排放量顯著高于黑麥草處理，增幅為 21. 90%~51. 42%。同一綠肥品種下，翻壓處理的 N2O 累積排放量顯著高于覆蓋處理，增幅為 29. 72%~62. 21%。培養結束時，VB、VS、RB、RS 的 N2O 累積排放量分別是 CK 的 4. 36、2. 69、2. 86 和 2. 21 倍(圖 2b)。

　　各處理 CH4的累計吸收量隨培養時間延長不斷增加(圖 2c)。在培養至 91 d 時，各處理的 CH4累積吸收量均顯著高于 CK，從大到小的順序依次為 VB>VS>RB>RS，分別為 319. 23、216. 32、138. 10 和 36. 45 μg·kg-1 。翻壓綠肥處理的 CH4累積吸收量顯著高于覆蓋處理，VB 比 VS 增加了 102. 91 μg·kg-1 ，RB 比 RS 增加了 101. 65 μg· kg-1 。同種還田方式下，VB 比 RB、VS 比 RS 的 CH4累積吸收量分別增加 181. 14、179. 87 mg·kg-1 。

　　2. 3 綠肥不同還田方式下的增溫潛勢(GWP)

　　本試驗條件下，GWP 中 CO2的貢獻率最高，其次是 N2O，CH4對 GWP 的影響為負效應(表 2)。與對照相比，各綠肥處理均顯著提高了土壤的 GWP，VB、VS、RB 和 RS 處理分別是 CK 的 4. 99、3. 86、4. 26 和 3. 50 倍。同種還田方式下，光葉苕子處理的 GWP 顯著高于黑麥草，增幅為 10. 52%~17. 12%。同一綠肥品種下，翻壓處理的 GWP 顯著高于覆蓋處理，增幅為 21. 77%~29. 05%。

　　2. 4 綠肥不同還田方式對土壤微生物量碳、氮的影響

　　各處理微生物量碳(MBC)含量變化趨勢大致相同。前期持續上升，培養至第 35 天時達到最大值，VB、VS、 RB 和 RS 的值分別為 222. 57、222. 95、213. 28 和 207. 43 mg·kg-1 ，但第 14 天的微生物量碳與第 35 天沒有顯著差異，在 35 d 后土壤微生物量碳含量持續下降，但仍顯著高于對照(圖 3a)。在整個培養期中，施加綠肥的各處理微生物量碳含量始終顯著高于對照(P<0. 05)。在培養的前期和后期，翻壓處理的微生物量碳含量顯著高于覆蓋處理，第 91 天時 VB 比 VS 增加了 24. 99 mg·kg-1 ，RB 比 RS 增加了 29. 48 mg·kg-1 。

　　在培養期間，各處理微生物量氮(MBN)含量的變化趨勢與 MBC 含量基本一致(圖 3b)，都是隨著培養時間的增加，MBN 含量先上升然后下降，各處理對 MBN 含量有顯著影響。在第 14 天時 MBN 含量達到最大值，培養結束時各處理 MBN 含量分別是 CK 的 1. 73~3. 14 倍。翻壓處理的 MBN 含量顯著高于覆蓋處理，VB 比 VS 增加了 3. 42 mg·kg-1 ，RB 比 RS 增加了 2. 92 mg·kg-1 。

　　2. 5 土壤溫室氣體累計排放量及 GWP 與土壤微生物量碳氮相關性分析

　　通過對溫室氣體與微生物生物量碳氮的相關性分析發現，溫室氣體與微生物生物量碳氮顯著相關。土壤 CO2、N2O 累計排放量及 GWP 與微生物量碳、氮之間存在顯著正相關關系(P<0. 01)，CH4與微生物量碳氮之間存在顯著負相關關系(P<0. 01)(表 3)。

　　3 討論

　　3. 1 綠肥還田方式對土壤溫室氣體排放的影響

　　綠肥作為一種清潔的有機肥源，具有改良土壤、提高作物產量等作用，已在農業生產中被廣泛應用;但是綠肥還田會提高土壤 CO2和 N2O 的排放也得到了普遍證實[11-13]。如何降低綠肥利用過程中溫室氣體的排放是實現綠肥可持續利用的前提。本研究發現綠肥還田利用方式對土壤 CO2和 N2O 溫室氣體的排放有顯著影響，覆蓋還田較翻壓還田能顯著降低溫室氣體的排放，其原因可能在于一方面覆蓋還田與土壤接觸面小而導致分解速率低，同時地表覆蓋綠肥、秸稈等有機物料阻礙了土壤向大氣排放 CO2 [14-15];另一方面翻壓還田對土壤進行了較大強度的擾動，改善了土壤通氣性，新鮮有機物質翻壓進入土壤中，讓綠肥能更好的與土壤混合接觸導致分解速率更快，微生物呼吸速率加強，單位時間內排放的 CO2、N2O 更多。黃濤等[16]通過監測秸稈翻壓和秸稈覆蓋后在不同測定時期的 CO2排放速率，發現秸稈翻壓較秸稈覆蓋高出 16. 49 %~85. 96 %，本研究結果與其相似。成臣等[17]研究發現在土壤含水量適中、通氣狀況良好的環境下，硝化細菌和反硝化細菌的活性得到提高，此時土壤硝化作用及反硝化作用都能以較高速率進行且以 N2O 為主要產物。目前關于翻壓、覆蓋有機物料對土壤 CH4排放的影響結果存在不一致觀點。Bender 等[18]研究認為，當土壤理化性質、利用方式等發生改變，會影響 CH4氧化的基本條件，從而直接或間接的影響 CH4氧化。有研究認為，翻壓秸稈等有機物料的 CH4排放量比覆蓋處理的更多[19-20]。他們認為有機物料覆蓋在農田表面，有機物料在土壤表層進行有氧降解，其降解產物在土壤氧化層中還原產生 CH4的可能性較小。還有研究認為，有機物料翻壓對土壤吸收 CH4的影響大于地表覆蓋，這主要是由于改善了土壤通氣狀況，更有利于 CH4的氧化和對空氣中 CH4的吸收[21]。在本研究中，翻壓處理的土壤 CH4累積吸收量顯著高于覆蓋處理，這可能是由于覆蓋處理減小表層土壤水分蒸發，從而改善土壤結構，增加土壤充水空隙，對 CH4的吸收能力減弱[17]。另外，翻壓處理改善了土壤通氣狀況，在通氣良好、溫濕環境適宜的條件下時，甲烷氧化菌對于大氣中 CH(4 吸收)氧化能力加強[22]。綠肥不僅具有傳統意義上的

　　綠肥不僅具有傳統意義上的增加作物產量、培肥地力的作用和效果，同時對提升土壤微生物活性，增加土壤有機碳含量，控制雜草生長和病蟲害發生、改善土壤生態系統及節能減排等方面也發揮了很重要的作用[1]。翻壓還田后雖然可以為土壤提供大量的碳源和養分，促進土壤有機質的礦化分解和土壤養分的循環與轉化[5]，但不能有效的減少水土流失，特別是在坡耕地上，翻壓綠肥還田后使得土壤表層沒有受到保護，當降水較大時也會發生土壤流失的現象。覆蓋還田與翻壓還田相比不僅體現出降低成本和能耗的經濟價值，還體現出減少水土流失、改善土壤環境條件的生態價值。在本研究中，覆蓋還田的溫室氣體排放比翻壓還田更低，對生態環境的負面影響更小。因此覆蓋還田這一利用方式更加有利于生態環境的發展。

　　3. 2 不同綠肥種類對土壤溫室氣體排放的影響

　　本研究中綠肥還田對環境的負面影響主要是增加了 N2O 的排放量，但綠肥還田不僅能夠增加作物產量，還能替代化學肥料，減小環境代價。Sant 等[23]研究認為雖然綠肥增加了氮投入量以及 N2O 的排放量，但 N2O 的排放系數較低，且顯著提高了后季經濟作物的產量，最終單位產量的 N2O 的排放量更低。Fungo 等[24]研究發現當以腫柄菊(Tithonia diversifolia)作為綠肥向土壤投入 150 kg·hm-2 的氮時，N2O 的排放量低于施用 120 kg·hm-2 的氮肥(尿素)。這表明相比于化學肥料，來自綠肥的氮素比來自化肥的氮素更不容易損失，綠肥還田對環境的負面影響更小。豆科綠肥還田雖然增加了增溫效應，但由于其獨有的生物固氮功能，在還田后可以提升土壤有機碳儲量外還能為后季作物提供可觀的氮素[25]。

　　大量研究表明，有機物料的 C/N 會影響溫室氣體的排放，豆科作物碳氮比較禾本科作物低，在還田后對提高土壤溫室氣體排放較禾本科作物更為有效[26-27]。本研究中，不同綠肥種類對土壤溫室氣體排放也存在著較大差異，添加豆科綠肥(光葉苕子)土壤 CO2、N2O 累計排放量顯著高于禾本科黑麥草，這主要是因為，一方面豆科綠肥 C/N 禾本科低，更容易被微生物分解利用，刺激土壤呼吸。另一方面豆科綠肥腐解后更多氮素被排放出來，供微生物利用的氮源相對豐富且對氮的限制度較小，從而增加了 CO2、N2O 的排放[28]。在本研究中，豆科綠肥的 CH4 累積吸收量顯著高于禾本科綠肥，這可能是因為當土壤中 N2O 達到一定的濃度時，對產甲烷菌會具有一定的毒害作用，從而抑制了甲烷的產生[29]。土壤溫室氣體主要產生自微生物參與的復雜生物化學過程，因此與土壤微生物之間有著緊密的聯系[30-31]。在本研究中，豆科綠肥還田下的微生物碳氮在培養前期顯著高于禾本科處理，這為豆科綠肥的溫室氣體累計排放量高于禾本科綠肥提供了合理的解釋。

　　4 結論

　　綠肥還田顯著提高了土壤 CO2、N2O 溫室氣體的排放，增加了 GWP，提高了土壤微生物碳氮的含量。不同還田方式對溫室氣體排放存在顯著差異，覆蓋還田比翻壓還田顯著降低了溫室氣體的排放，豆科綠肥還田后溫室氣體的排放高于禾本科，因此，在不影響下一茬作物生產的前提下，采用綠肥自然枯萎覆蓋還田能減少溫室氣體排放、保護生態環境、節約人工成本，但是是否能實現增產和保護環境的雙贏有待進一步的田間試驗驗證。