作者：康毅 劉樹(shù)文 駱艷娥 但霞 單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心 西北大學(xué)化工學(xué)院

菌種保存培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母浸粉10，用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，121℃滅菌21min。發(fā)酵培養(yǎng)基基本成分與種子培養(yǎng)基相同，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌鞒煞窒鄳?yīng)改變。1.2儀器與設(shè)備SS-325型立式蒸汽滅菌鍋日本TomyKocyo公司；UV-1700型紫外分光光度計(jì)日本Shimadzu公司；QYC2102C型立式雙層恒溫?fù)u床上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RC5C+型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)美國(guó)科峻儀器公司。

菌種活化及種子培養(yǎng)將保藏菌種接種劃線(xiàn)，待長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落劃線(xiàn)，30℃恒溫培養(yǎng)，24h后于4℃冰箱保存待用。從平板上刮取單菌落，接入2個(gè)裝有50mL種子培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)pH值為6.0，121℃滅菌21min)的250mL搖瓶中，發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min條件下培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接于2個(gè)裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，再培養(yǎng)24h，條件同上。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)將經(jīng)轉(zhuǎn)接、擴(kuò)培后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基搖勻，500mL搖瓶裝液量為300mL，接種量3.3%，轉(zhuǎn)速100r/min，發(fā)酵溫度28℃。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)指標(biāo)測(cè)定生物量的測(cè)定發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后，使光密度(OD)值約在0.2～0.8之間，用分光光度計(jì)檢測(cè)其在560nm波長(zhǎng)處OD560nm值，所得OD560nm值乘以稀釋倍數(shù)來(lái)表示生物量。甘油產(chǎn)量測(cè)定采用甘油試劑盒測(cè)定。數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值，采用OriginPro8.0和Minitab數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

葡萄糖質(zhì)量濃度的影響由圖1可知，不同葡萄糖質(zhì)量濃度條件下，甘油在發(fā)酵8h時(shí)產(chǎn)量均達(dá)到最高，而當(dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度252g/L時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中甘油產(chǎn)量一直維持在相對(duì)較高的水平。葡萄糖初始質(zhì)量濃度108g/L時(shí)，生物量最先達(dá)到穩(wěn)定期，但甘油產(chǎn)量并不理想；過(guò)高的葡萄糖質(zhì)量濃度(252g/L)抑制了微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)較緩慢；葡萄糖初始質(zhì)量濃度為180g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)最為規(guī)律且生長(zhǎng)量最大。由圖2可知，當(dāng)果糖質(zhì)量濃度為108g/L和180g/L時(shí)，甘油產(chǎn)量在發(fā)酵60h時(shí)達(dá)到最高，分別為119.47μmol/L和37.93μmol/L。而果糖質(zhì)量濃度252g/L時(shí)，甘油產(chǎn)量在8h時(shí)達(dá)到25.29μmol/L。不同初始果糖質(zhì)量濃度對(duì)S.cerevisiae菌體生長(zhǎng)影響的差異不顯著。

pH值的影響由圖3可知，不同初始pH值對(duì)S.cerevisiae合成甘油的影響趨勢(shì)基本相同。發(fā)酵16h時(shí)各pH值條件下的甘油產(chǎn)量均降到最低，之后又有所增加，48h時(shí)各pH值條件下的甘油產(chǎn)量達(dá)到最高。pH2.0嚴(yán)重抑制了S.cerevisiae的生長(zhǎng)。綜合而言，pH3.5較適宜S.cerevisiae菌體生長(zhǎng)和合成甘油。

SO2添加量的影響由圖4可知，添加20、40、60、80mg/LSO2可以促進(jìn)S.cerevisiae發(fā)酵前期(≤8h)的甘油合成。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到24h時(shí)，添加60、80、100mg/LSO2條件下的S.cerevisiae甘油產(chǎn)量相對(duì)添加20mg/L和40mg/LSO2時(shí)高。但是60h后，添加20mg/LSO2中條件下的S.cerevisiae甘油產(chǎn)量明顯升高且沒(méi)有下降趨勢(shì)。各不同SO2質(zhì)量濃度添加量條件下，菌體生長(zhǎng)良好，差異不明顯。

發(fā)酵溫度的影響由圖5可知，不同溫度條件下，發(fā)酵進(jìn)行8h時(shí)，S.cerevisiae甘油產(chǎn)量明顯升高，16h時(shí)各發(fā)酵溫度條件下甘油產(chǎn)量均下降并為整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的最低值，而培養(yǎng)基發(fā)酵溫度22℃和28℃時(shí)，菌體生物量分別結(jié)束對(duì)數(shù)期達(dá)到穩(wěn)定。

Plackett-Burman試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表2，表中的“1”表示因子所取得的高水平值，“－1”表示低水平值，試驗(yàn)的響應(yīng)值為發(fā)酵液中甘油含量。Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果分析如表3所示，根據(jù)Minitab軟件系統(tǒng)的運(yùn)行規(guī)則，通過(guò)P值檢驗(yàn)來(lái)篩選顯著性因素[11]。當(dāng)因子所對(duì)應(yīng)的P＜0.05時(shí)，判斷該因子為顯著性因素，當(dāng)P＜0.01時(shí)對(duì)響應(yīng)值影響非常顯著[12]。據(jù)此判斷在本研究中pH值和SO2添加量為影響甘油產(chǎn)量的顯著因素。實(shí)驗(yàn)的置信水平為95%，根據(jù)表3中的系數(shù)值，得出響應(yīng)值的一次線(xiàn)性回歸擬合方程：Y＝461＋19.3X1＋10.7X2－20.8X3－77.8X4＋104X5(R2＝0.888)。由于X1、X2、X3均為非顯著性因素，因而將三者舍掉，將X4＝－1、X5＝1代入回歸方程，則Y＝642.8＜655.64，因此Plackett-Burman設(shè)計(jì)中第6種組合為最優(yōu)，即初始葡萄糖216g/L、果糖144g/L、發(fā)酵溫度32℃、pH3.0、SO240mg/L時(shí)，得到最大甘油產(chǎn)量655.64μmol/L。

本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖和果糖的最佳利用值分別為180g/L、108g/L，單以果糖為碳源的菌體生長(zhǎng)量明顯比葡萄糖低。有研究表明[13-14]，酵母生長(zhǎng)速率達(dá)到最大時(shí)起始單糖條件分別為：葡萄糖175g/L、果糖100g/L、蔗糖200g/L。果糖最適于酵母高產(chǎn)甘油，但不能被菌體有效利用用于生長(zhǎng)，搖床培養(yǎng)46h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，甘油濃度卻開(kāi)始下降。在Yalcin等[15]的研究中，pH4.0時(shí)，兩株S.cerevisiae均可獲得最大細(xì)胞干質(zhì)量，當(dāng)pH值升高或降低均阻礙菌體生長(zhǎng)，對(duì)另一種釀酒酵母Kalecik1而言，甘油產(chǎn)量隨pH值上升而增加。甘油產(chǎn)量最大時(shí)pH值為6.46，產(chǎn)率最大時(shí)pH值為5.92。研究認(rèn)為，高pH值條件下乙醛脫氫酶活性升高，產(chǎn)生的NADH促使磷酸二羥丙酮形成甘油，以維持細(xì)胞氧化還原平衡。本實(shí)驗(yàn)中pH值為3.5、6.0時(shí)甘油產(chǎn)量較高，pH值為4.5時(shí)的甘油產(chǎn)量較pH3.5小。pH值為2.0時(shí)甘油產(chǎn)量雖然一直較高，相應(yīng)的菌體生長(zhǎng)量卻非常低。可能是過(guò)低的pH值增加了酵母細(xì)胞的化學(xué)壓力，為了維持滲透壓平衡，細(xì)胞中甘油產(chǎn)量隨之升高。

向發(fā)酵基質(zhì)中添加SO2并不能阻止乙醛還原為乙醇，反而會(huì)促進(jìn)甘油的過(guò)量產(chǎn)生。實(shí)際生產(chǎn)中為了增加甘油產(chǎn)量，通常添加更多的SO2，增加1g/L的甘油至少要添加100mg/LSO2。本研究中發(fā)酵溫度28℃較有利于S.cerevisiaeD254合成甘油和生物量。但也有研究顯示，S.cerevisiae最大生長(zhǎng)速率出現(xiàn)在發(fā)酵溫度32℃時(shí)，22℃時(shí)酵母有最大生長(zhǎng)量[16]。與已知研究相比，雖然各影響因素范圍基本相同，但本研究中甘油產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于相關(guān)研究。原因可能是，本實(shí)驗(yàn)所選培養(yǎng)基成分單一，不利于甘油產(chǎn)生。研究表明，基質(zhì)組成對(duì)甘油產(chǎn)量有重大影響。在葡萄醪發(fā)酵中甘油和乙醇含量很高，殘?zhí)呛艿停谄咸烟恰⒐恰⒄崽堑群铣膳囵B(yǎng)基中結(jié)果相反。葡萄醪中的微量元素和氮、磷等其他化合物可能提高了甘油和乙醇途徑中酶的活性，加快甘油生成，而合成培養(yǎng)基缺乏這樣的條件。

本研究通過(guò)優(yōu)化影響S.cerevisiaeD254產(chǎn)甘油的因素，為提升葡萄酒品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。研究中分別對(duì)不同初始質(zhì)量濃度葡萄糖、果糖、pH值、發(fā)酵溫度及SO2添加量下S.cerevisiaeD254產(chǎn)甘油量進(jìn)行了比較，得出最佳初始條件為：其他因素固定條件下，葡萄糖質(zhì)量濃度180g/L時(shí)酵母菌體生長(zhǎng)平穩(wěn)、生長(zhǎng)量最高；果糖質(zhì)量濃度108g/L時(shí)酵母甘油產(chǎn)量最高；pH值為3.5更適宜酵母菌體生長(zhǎng)和合成甘油；在發(fā)酵溫度和SO2添加量的單因素試驗(yàn)中也分別得出適宜發(fā)酵溫度為28℃和適宜SO2添加量為20mg/L。通過(guò)單因素試驗(yàn)，篩選出最利于釀酒酵母D254生長(zhǎng)和產(chǎn)甘油的各因素的最佳質(zhì)量濃度，進(jìn)行Plackett-Burman發(fā)酵條件組合試驗(yàn)。優(yōu)化出的發(fā)酵條件組合為：初始葡萄糖質(zhì)量濃度216g/L、果糖質(zhì)量濃度144g/L、發(fā)酵溫度32℃、pH3.0、SO2添加量40mg/L，在此條件下，S.cerevisiaeD254可以獲得最大甘油產(chǎn)量655.64μmol/L。