本論文研究酸度、溫度、時(shí)間、鈣化合物添加量等因素對(duì)桔皮果膠鈣產(chǎn)量的影響，從而為桔皮資源的開(kāi)發(fā)、果膠鈣的生產(chǎn)和應(yīng)用、桔皮果膠的提取等方面提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

材料與方法

1.材料與儀器

桔皮：新鮮柑橘購(gòu)于廣州石牌東農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，桔皮烘干后粉碎，過(guò)20目篩、密封備用；濃氨水、鹽酸、氯化鈣、氫氧化鈣、乙醇均為分析純。內(nèi)徑8cm，長(zhǎng)度100cm的玻璃柱廣州精科化玻儀器有限公司；FC204型電子天平上海精科天平廠；PL602-S型電子天平梅利勒-托利多中國(guó)地區(qū)；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司；KDC-1044低速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司；精密pH計(jì)上海安亭雷磁儀器廠；冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

1）工藝流程桔皮過(guò)篩（20目）→滲漉脫色→晾干→酸法提取→過(guò)濾→調(diào)節(jié)濾液pH→鹽析沉淀→離心→冷凍干燥→果膠鈣成品。

2)操作要點(diǎn)

①滲漉:將桔皮粉裝入玻璃柱中，以60%乙醇滲漉，直至滲出液為淡黃色，將桔皮粉取出晾干后備用。此過(guò)程用以除去桔皮中的色素、橙皮苷等物質(zhì)。

②提取:稱取一定量經(jīng)過(guò)滲漉的干燥桔皮粉，按質(zhì)量體積比加入20倍蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=2，加熱微沸1h，趁熱用紗布過(guò)濾。提取兩次，合并濾液，得到果膠提取液。

③鹽析沉淀:濃氨水調(diào)節(jié)果膠提取液的pH，以0.013molCa/100g干桔皮的比例加入一定量氯化鈣，不同溫度水浴一定時(shí)間。選擇鹽析pH、水浴時(shí)間、水浴溫度、氯化鈣用量為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，觀察不同因素對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響。④離心3500r/min離心15min后，分別收集上清液和沉淀，測(cè)上清液的可溶性固形物含量并記下體積。

⑤冷凍干燥:將沉淀于-70℃凍結(jié)后進(jìn)行冷凍干燥。

3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

①pH對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:將由25g桔皮提取得到的果膠提取液均分為8等份，分別調(diào)節(jié)提取液的pH為8.25、8.50、8.75、9.00、9.25、9.50、9.75、10.00，固定其余各因素為：60℃水浴3h，每份加入4.0mL1.0mol/LCaCl2，考察pH對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響。②溫度對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:將由25g桔皮提取得到的果膠提取液調(diào)節(jié)pH后，均分為6等份，分別于20、30、40、50、60、70℃水浴，固定其余各因素為：pH=9.0，水浴3h，每份加入4.5mL1.0mol/LCaCl2，考察溫度對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響。③時(shí)間對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:由25g桔皮提取得到的果膠提取液調(diào)節(jié)pH后，均分為5等份，分別水浴2、4、6、8、10h，固定其余各因素為：pH=9.0，60℃水浴，每份加入6.5mL1.0mol/LCaCl2，考察時(shí)間對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響。④CaCl2用量對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:將由25g桔皮提取得到的果膠提取液調(diào)節(jié)pH后，均分為6等份，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol/LCaCl2溶液4.5mL，固定其余各因素為：pH=9.0，60℃水浴3h，考察CaCl2用量對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響。

2)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以pH、溫度、時(shí)間、CaCl2用量為實(shí)驗(yàn)因素，果膠鈣產(chǎn)量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平見(jiàn)表1(略)。1.4果膠鈣產(chǎn)量果膠鈣產(chǎn)量的計(jì)算公式如下：1010()100mVVm果膠鈣產(chǎn)量/%=式中：m1為凍干果膠鈣的質(zhì)量，g；V0為離心前提取液體積，mL；V1為離心后上清液體積，mL；ρ為離心上清液的可溶性固形物含量，%；m0為干燥桔皮的重量，g。1.5數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣的平均值，采用Excel軟件作圖，利用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

結(jié)果與分析

1)鹽析pH對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:鹽析pH對(duì)桔皮果膠鈣產(chǎn)量得影響如圖1所示。圖1表明，當(dāng)pH為8.25~8.75時(shí)，果膠鈣產(chǎn)量迅速增加；pH=8.75~9.75時(shí)，隨著pH的升高，果膠鈣產(chǎn)量增加趨勢(shì)變緩，在pH=9.75達(dá)到最高；繼續(xù)提高pH，產(chǎn)量下降。在一定范圍內(nèi)pH越高，越有利于果膠鈣形成。其原因應(yīng)當(dāng)是在堿性條件下，桔皮中的高甲氧基果膠能夠脫去甲氧基，暴露出更多的羧基陰離子而與陽(yáng)離子鈣結(jié)合，最大限度地使所有半乳糖醛酸鏈的游離羧基與鈣離子絡(luò)合形成“蛋箱結(jié)構(gòu)”（圖2，略），進(jìn)而形成凝膠[11]。有研究表明，在中性或微酸性條件下，高甲氧基果膠容易發(fā)生β-消除反應(yīng)，糖苷鍵斷裂、果膠分子量變小，不利于分子間交聯(lián)[12-13]。因此，堿性條件下形成果膠鈣與有關(guān)理論是一致的。但是pH過(guò)高，果膠脫酯反應(yīng)更迅速，果膠酯化度降低[14]，這雖然有助于果膠鈣形成，但是得到的果膠的膠凝力降低。所以，初步選定鹽析pH為9.75。

2)鹽析溫度對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:鹽析溫度對(duì)桔皮果膠鈣產(chǎn)量的影響如圖3(略)所示。由圖3可知，隨溫度升高，果膠鈣產(chǎn)量先升后降，溫度過(guò)高不利于果膠的鹽析，因此，初步選取鹽析溫度為50℃。該現(xiàn)象不符合溫度越高、分子運(yùn)動(dòng)越快而提高提取率的一般規(guī)律。這是因?yàn)樵诘蜏睾蛪A性介質(zhì)中，果膠發(fā)生皂化反應(yīng)被脫酯，加鈣離子容易凝膠；溫度較高的堿性條件下，半乳糖醛酸鏈的α-1,4糖苷鍵的斷裂更容易發(fā)生。這點(diǎn)與CatherineGarnier等[11]的研究結(jié)果一致。為了減少這一情況的發(fā)生，鹽析溫度不宜過(guò)高。

3)鹽析時(shí)間對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響:鹽析時(shí)間關(guān)系到果膠與鈣離子是否能充分結(jié)合，該因素對(duì)桔皮果膠鈣產(chǎn)量的影響如圖4(略)所示。圖4表明，鹽析時(shí)間在2-10h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，果膠鈣產(chǎn)量呈增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，8h時(shí)產(chǎn)量最高，因此初步選定鹽析時(shí)間為8h。

4)CaCl2用量的影響:氯化鈣用量對(duì)果膠鈣產(chǎn)量的影響如圖5(略)所示，圖5表明，果膠鈣產(chǎn)量隨氯化鈣添加量的增加而提高。在果膠溶液中，隨著體系鈣離子濃度的提高，果膠與鈣離子形成越來(lái)越多的“蛋箱”結(jié)合區(qū)，易構(gòu)成凝膠的三維結(jié)構(gòu)。同時(shí)，鈣離子結(jié)合兩條果膠分子鏈上的羧基離子，這樣疏水的甲酯基暴露在凝膠體外表面，協(xié)助果膠分子間脫水，更有助于果膠鈣結(jié)合區(qū)的穩(wěn)定[13,15]，這兩方面的作用使更多的果膠被分離出來(lái)。但是，當(dāng)果膠鏈上與鈣離子的結(jié)合區(qū)飽和后，再添加鈣離子只是增加了一些微弱的靜電力，對(duì)果膠鈣凝膠的貢獻(xiàn)非常小[16]。所以，初步選定氯化鈣用量為9.6g/100g桔皮。

5)正交實(shí)驗(yàn)分析：根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)得出的條件，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)以優(yōu)化提取條件。由于正交設(shè)計(jì)中沒(méi)有空白列，因此實(shí)驗(yàn)誤差只能通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得[17-18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3（略）。根據(jù)表2，各因素水平的優(yōu)劣順序?yàn)锳3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C1＞C2＞C3，D1＞D2＞D3，影響因素主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，確定的最佳組合為A3B1C1D1，即pH為10，鹽析溫度40℃，鹽析時(shí)間為6h，氯化鈣用量7.2g/100g桔皮。由表3的方差分析結(jié)果可知，pH、溫度、時(shí)間三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），CaCl2對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得果膠鈣的產(chǎn)量為19.67%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中的9組實(shí)驗(yàn)最高值（17.60%），說(shuō)明優(yōu)化后的組合為最佳組合。