前言

20世紀(jì)70年代，Garrison等首次在生活廢水中檢測(cè)到了藥物成分，引起社會(huì)上的廣泛關(guān)注。隨后，在污水處理廠、河流、湖泊、海洋、甚至飲用水中都檢測(cè)到了不同的藥物化合物［1］，如抗生素、降壓藥、降脂藥、止痛劑、抗抑郁藥、β受體阻滯藥、抗癌藥等。在歐洲，進(jìn)入到環(huán)境中的藥物活性成分已有4000余種［2］。這些藥物活性成分對(duì)水環(huán)境生態(tài)安全和人體健康已構(gòu)成威脅［3］。

四膜蟲(chóng)是一種單細(xì)胞原生動(dòng)物，是毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究中的優(yōu)良模式生物之一，并已廣泛應(yīng)用于藥物、無(wú)機(jī)物、有機(jī)物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)［4－6］。Bamadad等［7］在研究多環(huán)芳烴(PAHs)對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性損傷時(shí)，發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)有類(lèi)似于普遍存在于哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞上、與腫瘤細(xì)胞耐藥性有關(guān)的MDR泵，免疫細(xì)胞化學(xué)研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

卡培他濱(CAP)，即5'－脫氧－5－氟－N－［(戊氧基)羰基］胞啶，是一種對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性活性的口服細(xì)胞毒性制劑，在體內(nèi)可被代謝為5－氟尿嘧啶(5－FU)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。卡培他濱的代謝物中，除了5－FU，其它物質(zhì)在體外試驗(yàn)中均不具有細(xì)胞毒性。CAP、5－FU及其它代謝物主要通過(guò)腎臟排出，其中2.9%是以CAP原形排出(圖1)。根據(jù)IMSHealth2007的統(tǒng)計(jì)，2006年，CAP在歐洲的使用量為28827kg。由于使用量大，加之易溶于水(LogKow為4．5，Roche2008)，因此CAP及其代謝物對(duì)水生生態(tài)的影響不容忽視。目前對(duì)于環(huán)境中CAP殘留的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)極為缺乏，最近有報(bào)道指出，CAP對(duì)羊角月牙藻有很強(qiáng)的毒性，72h－ErC50為2.0mg/L［8］。而研究CAP對(duì)其他模式生物如四膜蟲(chóng)等影響的報(bào)道較為罕見(jiàn)。

本文以四膜蟲(chóng)為模式生物，研究了CAP對(duì)嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞的生長(zhǎng)以及多藥耐藥性(MDR)的影響，嘗試探索CAP的生態(tài)毒性問(wèn)題，為其科學(xué)管理提供依據(jù)。

1材料和方法

1．1試驗(yàn)用四膜蟲(chóng)和培養(yǎng)液

嗜熱四膜蟲(chóng)(TetrahymenaThermophila，SB210)由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所饋贈(zèng)。培養(yǎng)液:胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，溶于1L蒸餾水中。攪拌使其充分溶解后分裝于10mL試管和250mL錐形瓶中，用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min，冷卻后于4℃保存。

1．2試劑與儀器

胰蛋白胨和酵母提取物均為Oxide公司產(chǎn)品，葡萄糖(AR，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，羅丹明(RhodamineB，Sigma－Aldrich，購(gòu)自于DAHU)。自動(dòng)手提式滅菌鍋(YXQ－LS－18S，上海博訊)，光照培養(yǎng)箱(SPX－250B－G，上海博訊)，多功能酶標(biāo)儀(ThermoVarioskanFlash)，DSH－系列超凈工作臺(tái)程控儀(上海淀山湖凈化設(shè)備廠)，高速離心機(jī)(3K30，Sigma)。

1．3四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)

接種于裝有5mL無(wú)菌培養(yǎng)液的試管中，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48h，隨后移取試管中的培養(yǎng)液至250mL錐形瓶中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．4四膜蟲(chóng)濃度與OD值的關(guān)系

移取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四膜蟲(chóng)細(xì)胞液200μL至1.5mL離心管中，加入200μL1%的甲醛進(jìn)行固定。在顯微鏡下用原生動(dòng)物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品平行計(jì)數(shù)5次，最后取平均值，并計(jì)算出四膜蟲(chóng)細(xì)胞濃度。移取已知濃度的四膜蟲(chóng)細(xì)胞懸液，稀釋不同倍數(shù)。用96孔板讀數(shù)，并繪制四膜蟲(chóng)濃度與OD值關(guān)系曲線。

1．5CAP對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性試驗(yàn)

在裝有45mL無(wú)菌培養(yǎng)液的錐形瓶中，加入50μL不同濃度的CAP溶液，并接種5mL預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲(chóng)培養(yǎng)液，使CAP終濃度為0.25、1、4、16μM，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，另設(shè)無(wú)CAP的對(duì)照。30℃培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)時(shí)間取培養(yǎng)液于96孔板讀數(shù)，測(cè)定OD值，并根據(jù)四膜蟲(chóng)濃度與OD值關(guān)系曲線，計(jì)算出相應(yīng)的四膜蟲(chóng)濃度。

1．6CAP對(duì)四膜蟲(chóng)多藥耐藥性的影響試驗(yàn)

移取10mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四膜蟲(chóng)培養(yǎng)液于已滅菌的離心管中，分別加入10μL不同濃度的CAP溶液和10μL羅丹明B溶液(濃度為3mM)，使CAP終濃度為2和16μM，以CAP濃度0μM為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。在恒溫培養(yǎng)箱中30℃黑暗培養(yǎng)不同時(shí)間，離心收集細(xì)胞(1000g，6min)，并用pH為7.4的冰PBS洗滌3次，棄上清液，凍融3次以破碎細(xì)胞，隨后加入1mLPBS，室溫下12000rpm離心6min，取上清液加入96孔板，每孔加100μL。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)540nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2．1四膜蟲(chóng)濃度與OD值關(guān)系曲線

四膜蟲(chóng)濃度與OD值關(guān)系曲線見(jiàn)圖2，方程為y=0．0292x+0．051，R2=0．9891。2．2CAP對(duì)四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制作用四膜蟲(chóng)在培養(yǎng)24h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度明顯增加，48h后進(jìn)入穩(wěn)定期。在36h內(nèi)，不同測(cè)試濃度的CAP(0.25、1、4、16μM)對(duì)四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng)幾乎無(wú)影響(見(jiàn)圖3);在48h，CAP濃度為16μM組與對(duì)照組相比四膜蟲(chóng)濃度較低;但在隨后時(shí)間內(nèi)，CAP濃度為16μM組的四膜蟲(chóng)細(xì)胞濃度快速增加?？傮w而言，在實(shí)驗(yàn)藥物濃度范圍及暴露時(shí)間內(nèi)，未觀察到CAP對(duì)四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng)有明顯抑制。說(shuō)明CAP對(duì)四膜蟲(chóng)細(xì)胞的毒性作用不大，這有可能是因?yàn)檫M(jìn)入四膜蟲(chóng)體內(nèi)的CAP被四膜蟲(chóng)的MDR泵排出體外。

2．3CAP對(duì)四膜蟲(chóng)多藥耐藥性的影響

在一定體積的四膜蟲(chóng)懸液中加入羅丹明B，黑暗中培養(yǎng)不同時(shí)間，測(cè)定四膜蟲(chóng)體內(nèi)羅丹明B的積累(見(jiàn)圖4)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，四膜蟲(chóng)體內(nèi)羅丹明B的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，藥物濃度為2μM組的熒光強(qiáng)度略高于對(duì)照組和藥物濃度為16μM組。說(shuō)明CAP對(duì)四膜蟲(chóng)體內(nèi)染料的排出機(jī)制有一定影響，但不顯著。CAP作為抗癌常用藥物，只有在體內(nèi)被代謝為5－FU時(shí)才發(fā)揮相應(yīng)作用，而CAP本身并不能抑制腫瘤細(xì)胞的MDR。通過(guò)CAP對(duì)羅丹明B在四膜蟲(chóng)體內(nèi)積累的試驗(yàn)可以證實(shí)，CAP對(duì)四膜蟲(chóng)的MDR的影響亦不顯著。