分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

　　摘 要：分析超速離心技術(shù)(analytical ultracentrifugation，AUC)是檢測生物大分子溶液中生物物理性質(zhì)的重要技術(shù)，利用沉降速率(sedimentation velocity, SV)和沉降平衡(sedimentation equilibrium, SE)方法，通過紫外/可見光、干涉光以及熒光檢測器來記錄樣品池中生物大分子徑向濃度分布，以獲得其水力學(xué)、生物物理學(xué)特性。該文介紹了分析超速離心技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展、測試原理與數(shù)據(jù)分析方法，列舉了分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)性質(zhì)分析、蛋白質(zhì)與生物分子間相互作用測定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析以及蛋白類生物類似藥分析中的應(yīng)用實(shí)例，并展望了其在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用與發(fā)展前景。

　　李冬冬; 褚文丹; 李文奇， 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理 發(fā)表時(shí)間：2021-07-29

　　關(guān)鍵詞：分析超速離心技術(shù);沉降速率;沉降平衡;蛋白質(zhì)研究

　　分析超速離心技術(shù)(AUC)是通過記錄生物大分子在溶液中的沉降行為來表征其生物物理學(xué)性質(zhì)的一項(xiàng)經(jīng)典技術(shù)，在生命科學(xué)、尤其是蛋白質(zhì)科學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。利用分析型超速離心機(jī)的紫外/可見光、干涉光以及熒光檢測方法，進(jìn)行沉降速率(SV)或沉降平衡(SE)兩種模式的實(shí)驗(yàn)，可獲得蛋白質(zhì)的分子量、純度、聚集狀態(tài)以及生物分子間相互作用等信息，在蛋白質(zhì)研究中發(fā)揮重要作用。目前，分析超速離心技術(shù)已成為蛋白質(zhì)研究中必不可少的技術(shù)手段。

　　1 分析超速離心技術(shù)的產(chǎn)生及發(fā)展

　　1924 年，Svedberg 設(shè)計(jì)發(fā)明了第一臺(tái)分析超速離心機(jī)，用來分析膠體的尺寸與分布情況，因此獲得了 1926 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[1-3]。同期，Svedberg 利用分析超速離心技術(shù)分析測定了蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)和分子量，擴(kuò)展了分析超速離心技術(shù)的應(yīng)用范圍，開啟了該技術(shù)在生物大分子領(lǐng)域中的應(yīng)用[4-5]。1953 年，沃森與克里克提出了 DNA 的半保留復(fù)制機(jī)制猜想[6]。1957 年，Meselson 和 Stahlf 等利用分析超速離心技術(shù)分析了復(fù)制過程 DNA 的構(gòu)象特征，驗(yàn)證了 DNA 半保留復(fù)制機(jī)制，這一經(jīng)典案例被稱為生物學(xué)界“最漂亮的實(shí)驗(yàn)”[7]。

　　1947 年，貝克曼公司生產(chǎn)的分析超速離心機(jī) Model E，促進(jìn)了分析超速離心技術(shù)在生物大分子方面的應(yīng)用。然而，Model E 體積龐大、操作及維護(hù)非常復(fù)雜，限制了分析超速離心技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。直至 21 世紀(jì)初，貝克曼公司推出了新型號(hào)分析超速離心機(jī) ProteomeLab XL-A/I。隨后，Aviv Biomedical 公司開發(fā)了與分析超速離心機(jī)配套的商業(yè)化熒光檢測器及軟件。隨著計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理能力的提高，尤其是美國國立衛(wèi)生研究院 Peter Schuck 實(shí)驗(yàn)室對(duì)分析超速離心技術(shù)數(shù)據(jù)處理理論模型的改進(jìn)，使得其在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用得到了極大的促進(jìn)和發(fā)展[8-10]。2017 年，貝克曼公司推出了最新型號(hào)的分析超速離心機(jī) Optima AUC，數(shù)據(jù)檢測穩(wěn)定性更強(qiáng)，儀器操作也更加簡便。該技術(shù)發(fā)展歷程概述如圖 1 所示。

　　2 分析超速離心技術(shù)的原理與方法

　　2.1 分析超速離心機(jī)的組成

　　分析超速離心機(jī)主要由動(dòng)力系統(tǒng)和光學(xué)檢測系統(tǒng)組成[11]。

　　動(dòng)力系統(tǒng)包括驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、防護(hù)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)子和樣品池;前 4 部分與制備型超速離心機(jī)類似，但轉(zhuǎn)子和樣品池為分析超速離心機(jī)所特有。其中，轉(zhuǎn)子的材質(zhì)為鈦合金，按樣品個(gè)數(shù)不同分為 4 孔的 An-60Ti 和 8 孔的 An-50Ti 兩種型號(hào)。樣品池由中心件、藍(lán)寶石(或石英)窗口、墊片、螺絲和外殼組成，是分析超速離心機(jī)中唯一與樣品接觸的部件。

　　光學(xué)檢測系統(tǒng)有 3 種，分別為紫外/可見光吸收檢測器、干涉光檢測器和熒光檢測器，目前應(yīng)用較廣泛的是前兩種檢測器，熒光檢測器的應(yīng)用正在迅速發(fā)展中[12]。

　　紫外/可見光吸收檢測器與常用的紫外分光光度計(jì)原理類似，當(dāng)樣品在某波長內(nèi)有吸收時(shí)，記錄離心過程中樣品在轉(zhuǎn)子徑向上不同位置的吸光度，完成檢測。

　　干涉光檢測器應(yīng)用了光的干涉作用，當(dāng)光透過參比液和樣品時(shí)，由于二者的折射率不同導(dǎo)致光程變化，在收集器上等光程的點(diǎn)發(fā)生位移，干涉條紋位移距離與溶質(zhì)濃度成正比。通過監(jiān)測干涉條紋位移情況，可以獲得溶質(zhì)濃度在轉(zhuǎn)子徑向上隨時(shí)間的變化。干涉光數(shù)據(jù)利用 CCD 相機(jī)進(jìn)行收集，可以在瞬間完成，效率更高。

　　熒光檢測器內(nèi)部光學(xué)部件的組裝與共聚焦顯微鏡的光學(xué)元件相似，通過二極管激光器發(fā)射出 488 nm 的激發(fā)光，經(jīng)過一系列的光學(xué)元件，最終產(chǎn)生波長為 505~565 nm 的發(fā)射光到達(dá)光電倍增管(PTM)。PTM 接收到的發(fā)射光信號(hào)與樣品在轉(zhuǎn)子徑向位置的函數(shù)關(guān)系，可以作為進(jìn)一步分析處理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。與紫外/ 可見光吸收檢測器、干涉光檢測器相比，熒光檢測器在靈敏度及樣品選擇范圍上都得到了提高。但是，熒光檢測器需要樣品中熒光基團(tuán)的配合，會(huì)在一定程度上干擾分析物的天然特性[3]。

　　2.2 分析超速離心技術(shù)的基本原理

　　在分析超速離心機(jī)運(yùn)行時(shí)，樣品池中的溶質(zhì)懸浮于溶液中并在離心場作用下運(yùn)動(dòng)，受到的作用力分別為：離心力 Fs，浮力 Fb 和摩擦力 Ff，當(dāng) 3 者達(dá)到平衡，溶質(zhì)進(jìn)行速度為 u 的勻速沉降運(yùn)動(dòng)。由力學(xué)公式： 2 2 s b A A f 0 o M M F F F r r fu N N ? ? ?? ? ? ? ?? ? (1)其中，M 為溶質(zhì)顆粒質(zhì)量，NA 為阿伏伽德羅常數(shù)， ω為轉(zhuǎn)頭角速度，r 為旋轉(zhuǎn)軸心至界面的徑向距離， ω2 r 為離心加速度， ?o 為溶劑密度， p ? ?1/ ? 為微分比容(partial specific volume)，?p 為蛋白質(zhì)常數(shù) f 為摩擦系數(shù)。

　　得到：? ? 0 2 A u M 1 r N f ???? ? (2)定義沉降系數(shù) s，單位為 S(Svedberg，1S=10–13s)： 2 u s ? r ? (3)由 Einstein-Stokes 關(guān)系： B B h 6π kT kT D f ?R ? ? (4)其中，D 為擴(kuò)散系數(shù)，kB 為波爾茲曼常數(shù)，T 為絕對(duì)溫度，? 是溶劑粘度，Rh 為流體力學(xué)半徑。因此，由以上公式得到： 0 MD(1 ) s RT ??? ? (5)其中， ?0 為溶劑密度， R kN ? B A 為氣體常數(shù)，式(5)即為 Svedberg 方程。

　　顆粒置于離心場中在離心力作用下沉降，考察樣品池中與轉(zhuǎn)軸距離為 r，長度為 a，厚度為 dr 的體積元(如圖 2 所示)，溶質(zhì)通過 A 面是沉降與擴(kuò)散的綜合結(jié)果。

　　可以得到在單位時(shí)間內(nèi)沉降的凈溶質(zhì)量 ms ： d s 2 · d m c ra u c ar s r t ? ? ? ? ?? ? ? ? (6)其中， c 為距離 r 處的溶質(zhì)濃度，? 為有效微分比容。在單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散的凈溶質(zhì)量 mD ： D d d m c D ar t r ? ?? ? ? ?? (7)因此，單位時(shí)間內(nèi)體積元的溶質(zhì)改變量為： d 2 d m c ar cs r D t r ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? (8)另一方面，體積元內(nèi)溶質(zhì)隨時(shí)間的變化為： d /d d 1 d d c mV m t t t ar r ? ? ?? ??? ? (9)代入上式即得到 Lamm 方程： c c 1 2 D s rr trr r ??? ? ? ?? ? ?? ? ? ?? ? ?? ??? ?? (10)當(dāng) s 和 D 不隨溶質(zhì)濃度發(fā)生變化，式(10)可寫作 2 2 2 1 2 c cc c D r cs t rr r r ?? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ??? ?? ?(11)通過 Lamm 方程可以認(rèn)識(shí)到，溶質(zhì)濃度隨時(shí)間和距離的變化由沉降和擴(kuò)散兩方面決定。在沉降速率實(shí)驗(yàn)中，解式(11)就可以獲得 s 和 D，再與 Svedberg 方程結(jié)合，可以得到溶質(zhì)的分子量 M。在沉降平衡實(shí)驗(yàn)中，溶液中溶質(zhì)濃度不再隨時(shí)間發(fā)生變化，式(10)等式為 0，方程有精確解，可以獲得精確度較高的分子量 M[8-10,13]。

　　2.3 分析超速離心技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法與數(shù)據(jù)處理

　　分析超速離心技術(shù)兩種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法分別是沉降速率法和沉降平衡法。

　　沉降速率實(shí)驗(yàn)是在較大的離心力作用下，樣品在較短時(shí)間內(nèi)全部沉降到樣品池底部，在不同時(shí)刻收集的數(shù)據(jù)可以反映該時(shí)刻在不同徑向位置的溶質(zhì)濃度，通過解析 Lamm 方程和 Svedberg 方程可以得到沉降系數(shù) s、擴(kuò)散系數(shù) D 和分子量 M 等信息[14]。沉降平衡實(shí)驗(yàn)是在較低的轉(zhuǎn)速下，不同濃度的樣品分別在不同轉(zhuǎn)速下達(dá)到沉降與擴(kuò)散的平衡，對(duì)沉降平衡數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析(global analysis)后得到分子量等信息[15]。

　　近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)處理模型的應(yīng)用，分析超速離心數(shù)據(jù)處理程序越來越多，如： DCDT、Ultrascan、SEDFIT/SEDPHAT 等。本實(shí)驗(yàn)室選擇的是由美國國立衛(wèi)生研究院的 Peter Schuck 等研發(fā)的 SEDFIT/SEDPHAT 軟件，由于其高可靠性、易操作和高效率，已成為目前應(yīng)用最為廣泛的分析軟件之一[16-17]。SEDFIT 主要用于沉降速率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，本實(shí)驗(yàn)室常用的是 Continuous c(s)Distribution Model，它利用 Lamm 方程模擬沉降邊界，代入方程進(jìn)行求解，然后利用最小二乘法將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化擬合，從而得到溶質(zhì)的具體信息。通過 c(s)即沉降系數(shù)分布模型計(jì)算結(jié)果可以得到各組分的分布比例、沉降系數(shù)以及擬合分子量等信息[18]。SEDPHAT 軟件主要用來分析沉降平衡實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)樣品沉降過程中達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，根據(jù) Lamm 方程可以得到更精確的分子量 M 值， SEDPHAT 軟件可以同時(shí)擬合多個(gè)濃度多個(gè)轉(zhuǎn)速的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到誤差率小于 2%的絕對(duì)分子量，此條件下要求實(shí)驗(yàn)樣品足夠均一。SEDPHAT 軟件還可以用來分析蛋白質(zhì)自聚集和相互作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算解離常數(shù)。

　　3 分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

　　蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的有機(jī)大分子，作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，在基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)以及疾病的預(yù)防與治療等方面發(fā)揮了重要作用。近年來，蛋白質(zhì)科學(xué)研究發(fā)展迅速，新的蛋白質(zhì)研究技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。目前有多種方法可以對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)和相互作用進(jìn)行研究，如紫外、熒光、紅外等光譜儀可以分析蛋白質(zhì)光學(xué)特性;瓊脂糖凝膠、高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)可以分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量;圓二色光譜儀可以分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu);X-射線晶體學(xué)、冷凍電鏡以及核磁等技術(shù)可以分析蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu);表面等離子體共振技術(shù)(surface plasmon resonance, SPR)、等溫滴定微量熱技術(shù)(isothermal titration calorimetry, ITC)、微量熱泳動(dòng)技術(shù)(microscale thermophoresis, MST)等可以檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。隨著分析超速離心技術(shù)的發(fā)展，其在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用也更加廣泛，優(yōu)勢也更加突出。從蛋白質(zhì)均一性、分子量的測定，到蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，再到蛋白質(zhì)相互作用、結(jié)合比例的測定以及蛋白類生物類似藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)，分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)性質(zhì)分析方面發(fā)揮越來越重要的作用。

　　本文統(tǒng)計(jì)了近 30 年來分析超速離心技術(shù)相關(guān)的科研文獻(xiàn)，結(jié)果表明文章發(fā)表數(shù)量呈明顯上升趨勢。此外，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明蛋白質(zhì)研究是分析超速離心技術(shù)應(yīng)用的主要方面，2019 年發(fā)表的分析超速離心技術(shù)相關(guān)文章中，蛋白質(zhì)研究占比 77%，遠(yuǎn)高于分析超速離心技術(shù)在其他方面的應(yīng)用，如圖 3 所示。本文主要介紹分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中不同方面的應(yīng)用。

　　3.1 可溶性蛋白質(zhì)性質(zhì)的測定

　　可溶性蛋白質(zhì)是指可以溶于水溶液的蛋白質(zhì)，在水溶液中以分散態(tài)存在。分析超速離心技術(shù)對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的檢測分析，可以獲得多項(xiàng)表征蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的信息，如沉降系數(shù)、分子量、摩擦系數(shù)以及軸長比等。

　　本實(shí)驗(yàn)室利用分析超速離心技術(shù)研究了擬南芥 SnRK2.6(sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2.6)末端多聚酸性氨基酸序列對(duì)蛋白溶液性質(zhì)的影響，并將多聚酸性氨基酸序列連接至擬南芥 PYL10 (PYR like protein 10)分子末端進(jìn)行分析。通過 AUC 方法確認(rèn) SnRK2.6 蛋白在溶液中以單體形式存在，多聚酸性氨基酸序列會(huì)引起分子軸長比增加，水合半徑增大，分子排阻層析洗脫體積明顯變小，因此利用分子排阻層析法判斷蛋白質(zhì)分子在溶液中的聚合狀態(tài)，需要非常謹(jǐn)慎[19]。

　　3.2 膜蛋白性質(zhì)的測定

　　膜蛋白是生物功能的重要承擔(dān)者，在細(xì)胞間接觸、表面識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、酶活性和運(yùn)輸?shù)确矫姘缪葜匾巧Ｔ谀さ鞍椎募兓^程中通常需要添加去垢劑來促進(jìn)膜蛋白的溶解，而不同種類的去垢劑及其用量會(huì)對(duì)膜蛋白的理化性質(zhì)、聚集狀態(tài)產(chǎn)生不同影響。分析超速離心技術(shù)可以測定膜蛋白-去垢劑復(fù)合物在離心過程中的沉淀行為，分析獲得其水力學(xué)參數(shù)，判斷膜蛋白在不同去垢劑中的均一性及聚集狀態(tài)。

　　γ-分泌酶是由 4 個(gè)亞單位組成的膜內(nèi)蛋白水解酶，參與 β-淀粉樣前體蛋白的水解過程，在阿爾茲海默癥發(fā)病中扮演了重要角色。周瑞等使用分析超速離心技術(shù)對(duì)功能缺失的 γ-分泌酶突變體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) γ-分泌酶突變體在洋地黃皂苷(digitonin)、丙磺酸鹽(CHAPSO)去垢劑中具有不同的形態(tài)，在 digitonin 中是單體的狀態(tài)，而在 CHAPSO 中呈現(xiàn)寡聚的狀態(tài)[20]。

　　本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的相關(guān)文章也闡述了分析超速離心技術(shù)在研究膜蛋白性質(zhì)中的應(yīng)用，文章以嗜熱菌來源的 ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)TmrAB 作為研究對(duì)象，利用 AUC 技術(shù)，研究其均一性、聚合狀態(tài)以及去垢劑與膜蛋白的摩爾比等性質(zhì)。研究得到在去垢劑 DDM 濃度為 8 倍 CMC 條件下，TmrAB 以異二聚體的單體形式存在，狀態(tài)均一，DDM 與 TmrAB 的摩爾比為 116∶1，證明分析超速離心技術(shù)是一種測定膜蛋白分子量、研究膜蛋白聚合狀態(tài)的可靠手段[21]。

　　3.3 蛋白質(zhì)自聚集分析

　　蛋白質(zhì)自聚集是廣泛存在的一種蛋白質(zhì)自相互作用現(xiàn)象，是生命活動(dòng)中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。因其單組分的特性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)自聚集親和力分析具有一定的難度，如常見的 SPR、ITC、MST 等方法都只能用來測定不同蛋白質(zhì)之間的相互作用。分析超速離心技術(shù)是為數(shù)不多的可以用來測定自聚集親和力的方法。SE 方法可以通過不同聚合模型的擬合來分析結(jié)合解離常數(shù)，適合分析樣品的動(dòng)態(tài)聚集;SV 方法可以對(duì)不同濃度下實(shí)驗(yàn)樣品的沉降系數(shù)分布進(jìn)行整體分析，獲得樣品結(jié)合解離信息，測定從 pM 到 mM 的親和力[22-23]。

　　早在 20 世紀(jì) 30 年代，Shire 等就開始運(yùn)用 SV 的方法分析不同濃度下蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)[24]。在對(duì) gp57A 自聚集現(xiàn)象的研究中，研究者也是利用 SV 方法最終確定了 gp75A 的聚合方式[25]。

　　本實(shí)驗(yàn)室與美國國立衛(wèi)生研究院 Peter Schuck 團(tuán)隊(duì)合作開展的最新研究，以常見商用蛋白 β-lactoglobulin 的同型二聚作為模型，準(zhǔn)確測定了其自聚集平衡結(jié)合常數(shù)，為蛋白質(zhì)自聚集研究提供了一種完整的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。文章詳細(xì)介紹了蛋白質(zhì)自聚集實(shí)驗(yàn)中儀器校準(zhǔn)、沉降速率設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果統(tǒng)計(jì)評(píng)估等步驟，建立了一套應(yīng)用分析超速離心技術(shù)研究蛋白質(zhì)自聚集的標(biāo)準(zhǔn)方案，對(duì) AUC-SV 方法在自聚集方面的應(yīng)用提供了有效指導(dǎo)[26]。Yang 等利用上述方法研究了嗜乳脂蛋白 BTN3A1 的自聚集情況，其二聚體解離成單體的解離常數(shù)為 1.1 mM[27]。

　　隨著熒光檢測系統(tǒng)(fluorescence optical detection system，F(xiàn)DS)的應(yīng)用開發(fā)，分析超速離心設(shè)備檢測靈敏度大大提升，F(xiàn)DS-SV 方法可以分析更高親和力的自聚集現(xiàn)象。Zhao 等利用谷氨酸受體 GluA2 氨基末端結(jié)構(gòu)域作為高親和力同源二聚的模型，研究了熒光標(biāo)記的選擇對(duì)自聚集結(jié)合常數(shù)的影響。結(jié)果表明， Dylight488 標(biāo)記的 GluA2 和 EGFP 融合蛋白表達(dá)的 GluA2，解離常數(shù)與天然 GluA2 一致，分別為 20.5 nM 和 25.4 nM，而 FAM(5,6-羧熒光素)標(biāo)記的 GluA2 解離常數(shù)約為 2.3 nM。此研究一方面說明 FDS-SV 可以進(jìn)行 nM 級(jí)高親和力的測定，另一方面也提示應(yīng)用 FDS-SV 需要選擇合適的標(biāo)記方法才能得到更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[28]。

　　3.4 蛋白質(zhì)與生物分子間相互作用的測定

　　蛋白質(zhì)與生物分子間相互作用在信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及其他生命過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。近年來，蛋白質(zhì)與生物分子間相互作用方面的研究發(fā)展迅速，許多傳統(tǒng)和新興技術(shù)運(yùn)用到分子相互作用的測定中[30]。分析超速離心技術(shù)的兩種實(shí)驗(yàn)方法 SV 和 SE 均可應(yīng)用在蛋白質(zhì)與生物分子間相互作用的研究中。

　　SV 是通過樣品在不同濃度下得到的沉降系數(shù)分布對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，隨著樣品濃度的變化沉降系數(shù)出現(xiàn)明顯偏移，說明在沉降過程中有相互作用發(fā)生。另外，SV 還可以完成多種信號(hào)的同時(shí)采集(multi-signal SV，MSSV)，對(duì)復(fù)合物的檢測分析更加完整。MSSV 可以通過混合物中不同組分的光譜特征去研究其各自的沉降系數(shù)分布，然后再進(jìn)行整體分析，得出各個(gè)組分在混合物中的比例。與 SV 相比，SE 在蛋白質(zhì)與生物分子相互作用研究中的應(yīng)用時(shí)間更久，其明顯優(yōu)勢在于可以同時(shí)記錄不同濃度、不同轉(zhuǎn)速下的樣品平衡情況，進(jìn)行整體分析，得到更準(zhǔn)確的測試結(jié)果[31]。

　　3.4.1 蛋白質(zhì)間相互作用的測定

　　蛋白質(zhì)間相互作用對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)具有重要意義。分析超速離心技術(shù)的 SV 實(shí)驗(yàn)可以分別將單獨(dú)的蛋白和蛋白復(fù)合物進(jìn)行相同條件下的離心沉降，根據(jù)沉降系數(shù)、分子量的變化，判斷相互作用是否發(fā)生，調(diào)整復(fù)合物中不同蛋白質(zhì)的比例，還可以獲得相互作用的化學(xué)計(jì)量比和解離常數(shù)。SE 實(shí)驗(yàn)可以在不同樣品濃度、不同的轉(zhuǎn)速條件下檢測蛋白復(fù)合物的沉降平衡狀態(tài)，進(jìn)而分析獲得蛋白相互作用的解離常數(shù)。EisemannT 等在對(duì)端錨聚合酶的研究中，通過 SV 和 SE 實(shí)驗(yàn)，結(jié)合 ITC 檢測結(jié)果，證明了 TNKS(human tankyrase-1)和 GMD(GDP-mannose 4,6- dehydratase)是以 1∶1 比例結(jié)合，為蛋白復(fù)合物晶體樣品制備提供了重要參考信息[32]。Brown 等在 2008 年發(fā)表的方法學(xué)文章詳細(xì)描述了 SV 方法測定蛋白相互作用的基本原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、數(shù)據(jù)處理等具體信息[33]。Zhao 等正是利用該方法結(jié)合熒光檢測系統(tǒng)，成功測定了 20.5 pM 的抗體與 FGFP 親和力，進(jìn)一步提高了 SV 方法在親和力方面的檢測范圍[34]。

　　3.4.2 蛋白質(zhì)與核酸相互作用的測定

　　蛋白質(zhì)與核酸的相互作用存在于生物體的多個(gè)生命過程中，如 DNA 的復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及反轉(zhuǎn)錄等，分析超速離心技術(shù)也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。Philo 等在研究雞卵溶菌酶與 DNA/RNA 配體的相互作用中，應(yīng)用 AUC-SV 方法，結(jié)合熒光偏振和 ITC 技術(shù)進(jìn)行分析，證明了此相互作用具有靜電特征，鹽濃度和溫度的變化都會(huì)引起親和力改變[35]。Ortega 等同時(shí)運(yùn)用分析超速離心技術(shù)的 SV 和 SE 兩種方法研究表明，在無光照情況下 AdoB12 可以誘導(dǎo) TtCarH 形成四聚體，四聚體 TtCarH 可以結(jié)合 DNA[36-37]。

　　3.4.3 小分子誘導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用的測定

　　小分子通常是指分子量小于 1 000 Da 的分子，如多肽、植物激素、金屬離子、藥物分子等。小分子通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用參與多種生命活動(dòng)，如植物激素調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)等。植物磺肽素(phytosulfokine， PSK)是一種含兩個(gè)酪氨酸磺化修飾的五肽激素，在植物體中作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。王繼縱等于 2015 年在對(duì)植物磺肽素的研究中，通過 SV 實(shí)驗(yàn)分別檢測了存在或缺失 PSK 的情況下，體細(xì)胞胚胎是否發(fā)生受體樣激酶( SERK ) 和 PSK 受體激酶 (PSKRLRR)異二聚化沉降行為，結(jié)果表明 PSK 可以誘導(dǎo) PSKR 與 SERK 發(fā)生異源二聚[38]。

　　3.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的應(yīng)用

　　在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中，蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備過程影響著樣品的質(zhì)量，如蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)、均一性、單分散程度等，進(jìn)而影響小角散射、X 射線衍射、核磁共振或冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法的實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果。利用分析超速離心技術(shù)，可以協(xié)助判斷不同條件下蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量，有助于節(jié)省后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。

　　另外，分析超速離心技術(shù)還可以與小角散射(SAS)技術(shù)聯(lián)用，幫助解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。用于 SAS 的樣品通常是高度純化和單分散的，但也存在輕微的聚集擾亂數(shù)據(jù)質(zhì)量，去除聚集物的影響是 SAS 技術(shù)面臨的重大挑戰(zhàn)。分析超速離心技術(shù)可以獲得溶液中各組分濃度的分布信息，將多組分溶液的 SAS 信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行分解。Morishima 等在最新的研究中采取 AUC-SAS 聯(lián)用方法，成功分析了含有高聚體的溶液中特定單體的 SAS信號(hào)強(qiáng)度以及弱相互作用體系中復(fù)合物的 SAS信號(hào)強(qiáng)度，有利于后續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)解析過程[39]。

　　3.6 蛋白質(zhì)構(gòu)象變化分析

　　蛋白質(zhì)構(gòu)象變化在生物信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Kreiner 等利用分析超速離心對(duì) FIII9′-10 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同構(gòu)象的 FIII9′-10 蛋白的沉降系數(shù)存在明顯差異，說明分析超速離心方法是測定蛋白構(gòu)象變化的有效手段[40]。

　　在最新發(fā)表的文章中，Brautigam 等利用分析超速離心技術(shù)，以牛血清蛋白(BSA)和突變的葡萄糖結(jié)合蛋白(TpMglB-2WA)為研究對(duì)象，驗(yàn)證了沉降速率法和差異沉降速率法( difference sedimentation velocity，DSV)可以有效地檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[41]。結(jié)果表明，4%重水可以引起 BSA 構(gòu)象變化;D-葡萄糖可以誘導(dǎo) TpMglB-2WA 蛋白的構(gòu)象變化，與晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)一致[42]。Brautigam 等同時(shí)開發(fā)了免費(fèi)專業(yè)軟件 DiSECT，用于處理 DSV 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以有效地降低噪音信息，獲得微小的沉降系數(shù)差，進(jìn)一步提升了數(shù)據(jù)處理與分析能力。此成果將有效推動(dòng)分析超速離心技術(shù)在檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化方面的應(yīng)用。

　　3.7 蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用

　　近年來，蛋白質(zhì)藥物發(fā)展迅速，在一些疾病治療方面顯示出明顯優(yōu)勢。蛋白質(zhì)藥物聚集體會(huì)引起患者的不良免疫反應(yīng)，蛋白質(zhì)藥物的聚集狀態(tài)是影響藥物質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。分析超速離心技術(shù)可以在溶液狀態(tài)下對(duì)蛋白質(zhì)藥物制品進(jìn)行直接測定，得到更加精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，被越來越多地應(yīng)用在醫(yī)藥研發(fā)中。

　　凝血因子Ⅷ(fVIII)是治療 A 型血友病的有效藥物，重組 fVIII 蛋白往往具有一定的免疫原性，被次氯酸鹽氧化后的重組 fVIII 免疫原性增強(qiáng)。為了研究氧化誘導(dǎo)的免疫原性和分子聚集之間的潛在聯(lián)系， Zakas 等通過分析超速離心技術(shù)對(duì)氧化前后的重組 fVIII 產(chǎn)品 Helixate 進(jìn)行分析，結(jié)果表明氧化誘導(dǎo)的免疫原性不用于聚集介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，為 fVIII 免疫原性機(jī)制的多樣性研究提供了有力證明[43]。

　　隨著原研蛋白類生物藥專利到期，蛋白類生物類似藥研發(fā)成為醫(yī)藥研發(fā)的重要方向。在蛋白類生物類似藥申報(bào)中，聚集體的檢測作為一項(xiàng)重要指標(biāo)，在進(jìn)行蛋白類生物類似藥一致性評(píng)價(jià)時(shí)非常關(guān)鍵。FDA 在蛋白類生物類似藥指導(dǎo)原則中提出須使用多種分析方法來評(píng)估同一性質(zhì)，建議使用分析型超速離心技術(shù)(AUC)與尺寸排阻色譜(SEC)等方法共同檢測分析藥物聚集體，但 SEC 通常無法檢出非共價(jià)結(jié)合的低聚物。AUC 技術(shù)檢測樣品不需要標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記物，也不需要與基質(zhì)相互作用，檢測器的高靈敏度使得檢測結(jié)果更精準(zhǔn)，已成為 FDA 檢測蛋白藥物非共價(jià)聚集的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

　　4 展望

　　基于扎實(shí)的熱力學(xué)和流體力學(xué)理論，分析超速離心技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用，但也存在一定的局限性。分析超速離心技術(shù)要求被檢測樣品純度高、濃度適宜，對(duì)于細(xì)胞裂解液、血漿、尿液等含有高濃度、復(fù)雜成分的樣品無法直接測量。在檢測生物分子間相互作用的應(yīng)用中，與 ITC、SPR、MST 等技術(shù)相比，分析超速離心技術(shù)所需測試時(shí)間較長(從 SV 實(shí)驗(yàn)的幾小時(shí)到 SE 實(shí)驗(yàn)的幾十小時(shí))，因此對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性要求較高。

　　隨著熒光檢測器的發(fā)展和數(shù)據(jù)處理軟件的優(yōu)化，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)高濃度樣品或復(fù)雜成分樣品的有效檢測。目前已有部分應(yīng)用案例如對(duì)高濃度的單克隆抗體以及模擬的人血漿樣品的測試分析[44]。分析超速離心機(jī)還可以進(jìn)一步整合其他檢測手段，如光散射檢測法，擴(kuò)展分析超速離心技術(shù)的應(yīng)用范圍。此外，目前的分析超速離心數(shù)據(jù)處理軟件操作繁雜，進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)據(jù)處理過程，也是未來的發(fā)展方向之一。