水稻心白突變體xb1的淀粉理化特性分析

　　摘 要: 淀粉是稻米胚乳的主要成分，解析其理化特性對改良水稻品質具有十分重要的意義。為了探究心白稻米淀粉的理化特性，本研究以經 EMS 誘導粳稻品種遼星 1 號獲得的心白突變體 xb1 為材料，利用掃描電鏡、激光粒度分析儀、RVA 快速黏度分析儀、差示掃描量熱儀等方法，對形態(tài)結構、淀粉顆粒結構和粒徑分布、糊化特性及熱力學特性等進行了分析。結果表明，與野生型相比，突變體 xb1 籽粒的粒寬、粒厚和千粒重均顯著降低; 淀粉結構和淀粉粒粒徑分布均發(fā)生改變，淀粉粒粒徑值大于 13 左右的淀粉粒數量明顯低于野生型; 突變體種子中蛋白質含量極顯著高于野生型，總淀粉含量極顯著低于野生型，而直鏈淀粉含量沒有明顯改變; 在支鏈淀粉分支結構上，聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及 25 ～ 35 之間的中長鏈比例有所增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例有所減少; 突變體 xb1 淀粉的糊化起始溫度( To) 、峰值溫度( Tp) 、終止溫度( Tc) 和糊化距離( Tr) 均未發(fā)生明顯改變，只有熱焓值( △H) 極顯著提高。同時，突變體 xb1 的 RVA 譜特征值中，熱漿黏度( HPV) 、峰值黏度 ( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值( SBV) 極顯著提高，崩解值( BDV) 和回復值( CSV) 極顯著降低。本研究結果為探索堊白形成的生理機制以及進一步的基因克隆奠定了基礎。

　　呂軍; 姜秀英; 劉軍; 解文孝; 韓勇; 沈楓， 核農學報 發(fā)表時間：2021-08-05

　　關鍵詞: 水稻; 心白突變體; 淀粉; 理化特性

　　隨著生活水平的日益提高，人們對稻米品質尤其是食味品質有了更高的要求。淀粉是稻米胚乳的主要成分，其組成、結構和理化特性決定了稻米的外觀品質和食味品質[1-3]。因此，深入研究水稻淀粉特性，對改良水稻品質具有十分重要的意義。

　　堊白是由于籽粒灌漿不充分，胚乳中的淀粉和蛋白顆粒排列疏松，相互間存在的空隙影響了光的透射而形成的白色不透明部分。根據其在胚乳上的不同位置可分為腹白、背白和心白等多種類型[4-6]。胚乳淀粉排列不緊密，導致米粒在加工過程中易斷裂，整精米率降低，蒸煮后米粒斷裂，影響食味品質[7-8]。

　　長期以來，已利用自然突變和人工誘變獲得了大量胚乳淀粉突變體材料，如堊白突變體、高直鏈淀粉突變體、糯性突變體、粉質突變體、糖質突變體、暗色突變體、皺縮突變體等[9-12]，其中已報道的堊白突變體有 gpa1、 osbt1、ospk2、flo4、flo5 等。并對這些突變體開展了淀粉合成相關研究，發(fā)現這些突變體的淀粉特性均發(fā)生了一定的變化，如直鏈淀粉含量、淀粉粘滯特性、熱力學特性、支鏈淀粉鏈長分布等。進一步通過基因克隆及功能研究，逐步明確了其在淀粉合成及調控中的作用。

　　Wang 等[13]發(fā)現突變體 gpa1 呈現白心胚乳，胚乳中復合淀粉顆粒呈圓形且包裹松散，該 突 變 基 因 OsRab5a 位 于 第 12 染 色 體，編 碼 一 個 GTP 酶 ( GTPase) ，參與胚乳細胞液泡中蛋白質的轉運。細胞壁轉化酶基因 GIF1，位于第 4 染色體，參與籽粒灌漿早期的碳源分配，該基因突變后產生心白，粒重、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量降低。Li 等[14]發(fā)現突變體 osbt1 呈現心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量降低，支鏈淀粉中短鏈增加，中長鏈減少，復合淀粉顆粒發(fā)育不正常，該突變基因 OsBT1 編碼 ADPG 轉運蛋白，在水稻種子發(fā)育過程中參與調控淀粉合成和復合淀粉顆粒的形成。Cai 等[15]發(fā)現突變體 ospk2 呈現心白表型，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著下降，蛋白和脂肪含量增加，支鏈淀粉中中短鏈比例降低，中長鏈增多，該突變基因 OsPK2 編碼一種質體丙酮酸激酶 ( pyruvate kinase PK) ，在淀粉合成、復合顆粒形成和籽粒灌漿過程中起重要作用。Flo4 是一個 T-DNA 插入突變體，胚乳呈現心白表型，粒重下降，蛋白質含量和脂肪含量增加，該突變基因 OsPPDKB 編碼丙酮酸磷酸雙激酶，在水稻胚乳淀粉代謝和結構中起重要作用[16]。flo5 突變體籽粒呈現心白表型，粒重減小，支鏈淀粉的長鏈[聚合度 ( degree of polymerization，DP) ≥30]顯著減少，快速黏度分析儀( rapid viscosity analyzer，RVA) 譜發(fā)生顯著變化，突變基因 SSIIIa 編碼淀粉合成酶，主要參與支鏈淀粉 B2-B4 鏈的延伸[17-18]。SSIIa 和 SSIIIa 雙突變植株中，胚乳支鏈淀粉的精細結構發(fā)生變化，短鏈和長鏈減少，中長鏈含量增加，雙突植株表現出明顯的堊白表型[19]。近幾年，一系列水稻 flo 突變體被鑒定，包括 flo12、flo14、flo15、flo16 等[20-24]，這些突變體的突變基因有些還未被克隆，有些雖已被克隆，但調控的分子機理尚不清晰。水稻胚乳淀粉的合成與調控是非常復雜又精細的過程，因此還需要挖掘更多胚乳淀粉突變體，進一步解析淀粉的生物合成途徑與調控代謝網絡，為稻米品質改良提供堅實的理論基礎。

　　本研究以經甲基磺酸乙酯 ( ethyl methane sulfonate，EMS) 誘導粳稻品種遼星 1 號獲得的心白突變體 xb1 為材料，對其表型特征及淀粉理化特性進行了分析，旨在了解心白突變的形成機制，為進一步的突變基因克隆和功能分析奠定基礎。

　　1 材料與方法

　　1. 1 突變體材料

　　遼星 1 號經 EMS 誘變處理，在其后代對胚乳堊白性狀進行篩選，從中發(fā)現一個能夠穩(wěn)定遺傳的、表型明顯的心白突變體，命名為 xb1。野生型遼星 1 號和突變體 xb1 種植于遼寧省水稻研究所試驗地，成熟期收獲籽粒，自然晾干，并在室溫下保存。

　　1. 2 突變體表型特征

　　利用 Laser Jet M1136 掃描儀( 惠普中國) 對野生型和突變體 xb1 的籽粒、糙米和糙米橫截面進行拍照。利用游標卡尺測量 10 粒種子的粒長、粒寬和粒厚，求平均值，重復 3 次。隨機選取 1 000 粒種子稱重，求平均值，重復 3 次。

　　1. 3 淀粉粒結構的掃描電鏡觀察

　　分別選取野生型和突變體 xb1 的完整精米樣品，用刀片將米粒橫向切開，使橫斷面向上，利用真空鍍膜儀對橫斷面鍍金后，在 JSM-7500F 掃描電鏡( 日本電子) 上觀察和拍照。

　　1. 4 淀粉粒的粒徑分布

　　淀粉提取: 將精米用 3 倍體積的亞硫酸鈉水溶液浸泡，精米充分吸收膨脹后，轉移至勻漿機中勻漿粉碎，隨后將勻漿液轉移至 200 目篩網中過濾，并用亞硫酸鈉水溶液充分清洗濾渣，收集濾液，靜置過夜，倒掉上清液，用新的亞硫酸鈉溶液清洗，重復 5 ～ 8 次，待淀粉呈白色，上清液透明時，徹底倒掉上清液，將淀粉自然晾干，轉移至恒溫箱中水分平衡 1 周，研缽研磨分散，過 200 目樣品篩。

　　取 100 mg 淀粉于干凈 EP 管中，加入 1 mL 75%酒精，渦旋混勻后超聲混勻，利用 Matersizer 3000 激光粒度分析儀( Malvern Instruments Ltd，Worcestershire，英國) 進行粒度分布測定，重復測定 3 次。

　　1. 5 總淀粉、直鏈淀粉和蛋白質含量測定

　　總淀粉含量測定: 稱取 100 mg 淀粉于 15 mL 試管中，加入 4 mL 80%乙醇，70℃放置 2 h，期間漩渦混勻。 12 000 r·min-1 離心 10 min，加 4 mL 80%乙醇，重復清洗 3 次。小心倒出上清，加入 0. 2 mL 80%乙醇，渦旋混勻，再加入 3 mL 耐熱 α-淀粉酶，沸水浴孵育 6 min，期間間斷渦旋混勻。將試管放置于 50℃ 的水浴鍋中，然后加入 0. 1 mL 淀粉葡糖苷酶，渦旋混勻，50℃ 孵育 30 min。用蒸餾水調節(jié)體積。取 0. 1 mL 至新的試管中，加入 3 mL GOPOG 試劑，渦旋混勻，于 50℃孵育 20 min，用 1510-04201 多功能酶標儀( 美國賽默飛公司) 于 510 nm 波長下測定吸光度值。

　　直鏈淀粉含量測定: 稱取 10 mg 淀粉于 EP 管中，加入 100 μL 乙醇，900 μL NaOH 溶液，渦旋混勻。沸水煮 10 min，待冷卻后定容至 10 mL。取 0. 5 mL 上清于離心管中，加入 0. 1 mL 乙酸，0. 2 mL 碘化鉀溶液，定容至 10 mL，室溫放置 10 min 顯色，用 1510-04201 型多功能酶標儀于 620 nm 處測定吸光度值。

　　蛋 白 質 含 量 測 定: 采用凱氏定氮法，利 用 KJELTEC2300 凱氏定氮儀( 丹麥 FOSS 公司) 測定野生型和突變體的蛋白質含量，重復 3 次，取平均值。

　　1. 6 支鏈淀粉鏈長分布

　　取已純化淀粉 5 mg，重懸于 5 mL 雙蒸水中，沸水浴 60 min，間斷渦旋混勻。取 2. 5 mL 的糊化樣品，加入 125 μL 醋酸鈉，5 μL 三氮化鈉和 5 μL 異淀粉酶， 38℃放置 24 h。加入 395 μL 硼氫化鈉，室溫放置 24 h。取 600 μL 于離心管中，室溫氮吹干燥。溶于 600 μL 流動相中，12 000 r·min-1 離心 5 min，取上清，用ICS5000 離子色譜系統(tǒng)進行檢測，采用電化學檢測器及 DionexTM CarboPacTM PA200( 3. 0 mm×250 mm) 離子色譜柱。流 動 相 A ( 100% 水 溶 液) ，流 動 相 B ( 100 mmol·L-1 NaOH、1 mol·L-1 NaAC) ，流 動 相 C ( 100 mmol·L-1 NaOH) ，流速為 0. 4 mL·min-1 ，柱溫為 30℃。每個樣品重復測定 3 次，取平均值。

　　1. 7 淀粉的粘滯特性

　　采用 3D 型 RVA 快速黏度分析儀 ( 澳 大 利 亞 Newport Scientific 公司) 測定。儀器自動讀出的一級參數有: 熱漿黏度( hot paste viscosity，HPV) 、峰值黏度 ( peak paste viscosity，PKV) 、冷 膠 黏 度 ( cool paste viscosity，CPV) 、糊化溫度( pasting temperature，PaT) ，二級參數有: 崩解值( breakdown viscosity，BDV = PKVHPV) 、消減值( setback viscosity，SBV = CPV-PKV) 、回復值( consistency viscosity，CSV = CPV-HPV) 。每個樣品重復測定 3 次，取平均值。

　　1. 8 淀粉的熱力學特性

　　采用 200-F3 差示掃描量熱儀( differential scanning calorimetry，DSC，德國 Netzsch 公司) 測量淀粉的熱力學特性。稱取 5 mg 米粉于鋁盤中，加入 10 μL 超純水，密封 2 h。升溫速率為 10℃·min-1 ，溫度范圍為 20 ～ 120℃。測定后根據測定曲線的吸熱峰邊界和面積，分析得到糊化起始溫度( onset temperature，To) 、峰值溫度 ( peak temperature，Tp ) 、終 止 溫 度 ( conclusion temperature，Tc) 熱焓值( enthalpy of gelatinization，△H) 和糊化距離( gelatinization range，Tr = Tc-To) 。每個樣品重復測定 3 次，取平均值。

　　2 結果與分析

　　2. 1 突變體的表型特征

　　突變體 xb1 是粳稻品種遼星 1 號經 EMS 誘變后篩選得到的能穩(wěn)定遺傳的胚乳堊白突變體，其種子表型與野生型( WT) 相似( 圖 1-A) ，而突變體 xb1 的糙米較野生型相比，中心呈現白色粉質不透明，邊緣一圈呈現透明，即心白表型( 圖 1-B、C) 。在籽粒表型性狀上，突變體 xb1 種子的粒長與野生型無顯著差異( 圖 1- D) ，但粒厚顯著低于野生型( 圖 2-F) ，粒寬和千粒重極顯著降低( 圖 1-E、G) 。

　　2. 2 突變體的淀粉粒結構和淀粉粒徑分布

　　利用掃描電鏡對野生型和突變體 xb1 糙米的橫切面進行觀察，野生型胚乳中的淀粉顆粒大小均一，排列較緊密，相互嵌合擠在一起呈現規(guī)則的多面體結構 ( 圖 2-A、B、C) ，而突變體 xb1 糙米的不透明部位胚乳中的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，顆粒與顆粒之間存在較大的間隙，形成卵圓形或正圓形( 圖 2-D、E、 F) ，說明突變體 xb1 的淀粉合成過程中出現了異常，導致淀粉結構的改變。

　　利用激光粒度分析儀對淀粉粒的粒徑值和粒徑分布進行測定，結果顯示( 圖 3) ，突變體 xb1 與野生型的淀粉粒大小分布相似，均呈單峰分布，但其分布曲線的峰值明顯高于野生型，且淀粉顆粒的大小分布范圍也相對集中。突變體 xb1 的平均粒徑( 11. 05 μm) 略小于野生型的平均粒徑( 11. 57 μm) ，但淀粉粒粒徑值大于 13 左右的淀粉粒數量明顯低于野生型。說明淀粉顆粒的粒徑分布受到心白突變的影響。

　　2. 3 突變體的種子成分分析

　　對突變體和野生型種子成分分析結果顯示( 圖 4) ，突變體的蛋白質含量極顯著升高，野生型種子的蛋白質含量為 8. 8%，突變體升高至 11. 2%。突變體的總淀粉含量極顯著減少，由 81. 5%減少到 78. 2%，而直鏈淀粉含量無顯著變化，說明該突變并未影響到直鏈淀粉的合成，而與蛋白質和淀粉中支鏈淀粉的積累存在密切的聯(lián)系。

　　2. 4 突變體的支鏈淀粉鏈長分布

　　為進一步分析突變體中支鏈淀粉結構，對突變體 xb1 和野生型的支鏈淀粉的鏈長分布進行測定，結果表明，突變體種子的支鏈淀粉鏈長分布發(fā)生了明顯變化( 圖 5) ，與野生型相比，突變體 xb1 的聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及 25 ～ 35 之間的中長鏈比例有所增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例有所減少，說明突變體 xb1 中支鏈淀粉的精細結構發(fā)生了改變。

　　2. 5 突變體淀粉的熱力學特性

　　由表 1 和圖 6 可知，突變體 xb1 的峰值溫度( Tp) 與野生型相近，起始溫度( To) 和糊化距離( Tr) 均略高于野生型，但差異不顯著，而終止溫度( Tc) 顯著高于野生型，熱焓值( △H) 極顯著高于野生型。表明該突變不會對糊化溫度產生太大影響，但會造成熱能值顯著提高。

　　2. 6 突變體淀粉的粘滯特性

　　利用快速黏度分析儀 RVA 對突變體與野生型的黏度特性進行了測定，結果顯示，兩者的淀粉黏度存在明顯差異( 表 2 和圖 7) 。從 RVA 譜特征值看，突變體 xb1 除了糊化溫度與野生型相近外，其他參數均發(fā)生了極顯著的變化，突變體 xb1 的熱漿黏度( HPV) 、峰值黏度 ( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值( SBV) 分別較野生型升高了 55. 9%、27. 0%、33. 1%和 111. 7%。崩解值( BDV) 和回復值( CSV) 分別較野生型降低了 34. 6%和 5. 8%。

　　3 討論

　　堊白不僅影響稻米的外觀品質，而且影響稻米的加工品質、營養(yǎng)品質和蒸煮食味品質，因而直接決定了稻米的市場價格和受歡迎程度[25-26]。而堊白的形成機制較為復雜，與水稻植株內“源庫流”的協(xié)調、籽粒灌漿動態(tài)及胚乳內淀粉的形成和積累密切相關，同時還易受環(huán)境條件的影響，因此，堊白性狀的研究是當前水稻品質研究的熱點和難點[27-31]。本研究篩選到一個穩(wěn)定遺傳的心白突變體 xb1，其籽粒的粒長未發(fā)生明顯改變，但粒寬、粒厚和粒重顯著低于野生型。電鏡掃描結果顯示突變體 xb1 的淀粉顆粒大小不一，排列比較疏松，呈現卵圓形或正圓形。激光粒度儀測定結果顯示突變體 xb1 的淀粉顆粒的粒徑分布發(fā)生了改變。說明突變體 xb1 的淀粉合成過程發(fā)生了異常，導致淀粉粒結構和分布發(fā)生改變。

　　淀粉是胚乳的主要成分，由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分組成。本研究結果表明，突變體 xb1 在直鏈淀粉含量沒有發(fā)生明顯變化的前提下，總淀粉含量極顯著降低，說明淀粉中支鏈淀粉含量極顯著減少。同時支鏈淀粉的鏈長分布也發(fā)生了顯著變化，相較于野生型，突變體 xb1 的聚合度( DP) 在 6 ～ 9 之間的短鏈及25 ～ 35 之間的中長鏈比例增加，而 DP 值在 10 ～ 24 之間的中短鏈及 36 ～ 50 之間的長鏈比例減少。前人研究表明，支鏈淀粉的結構被認為是決定淀粉顆粒結構及其功能特性的關鍵，也是造成直鏈淀粉含量相近的水稻品種間蒸煮食味品質差異的主要原因[32-33]。支鏈淀粉的生物合成較為復雜，主要由可溶性淀粉合成酶( SSS) ，淀粉分支酶( SBE) 和淀粉脫支酶( DBE) 共同催化合成。Satoh 等[34]研究發(fā)現，突變體 sbe1 的種子具有正常的表型，但中鏈( DP12 ～ 21) 和長鏈( DP > 37) 減少，而短鏈( DP < 10) 和中長鏈( DP24 ～ 34) 有所增加。本研究中突變體 xb1 的支鏈淀粉鏈長的變化特點，與突變體 sbe1 的變異特點一致，但突變體 xb1 是否含有 sbe1 的等位基因突變型，尚需要進一步驗證。

　　淀粉結構的改變會導致相應的理化指標的改變。目前關于稻米淀粉結構與淀粉理化特性的關系，不同研究者的研究結論不盡相同。Vandeputte 等[35]認為DP6 ～ 9 的短鏈相對數量與稻米淀粉的糊化起始溫度 ( To) 、最高溫度( Tp) 、終結溫度( Tc) 及起始成糊溫度 ( pasting temperature，PT) 呈負相關，而 DP12 ～ 22 鏈長呈現相反結果。賀曉鵬等[36]研究指出，支鏈淀粉不同鏈長范圍的支鏈數量比例主要與淀粉的糊化溫度相關，而與淀粉的膠稠度和 RVA 特征值關系不密切。而突變體 xb1 淀粉的糊化起始溫度 ( To ) 、峰 值 溫 度 ( Tp) 、終止溫度( Tc) 和糊化距離( Tr) 均未發(fā)生明顯改變，這與 RVA 譜參數中的糊化溫度較野生型沒有明顯差異的結論一致。這一結果可能是直鏈淀粉含量未發(fā)生改變導致的，即突變體 xb1 淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量關系較為密切。與此同時，突變體 xb1 的RVA 譜特征值均發(fā)生了顯著改變，DP6 ～ 9、DP25 ～ 35 的增加和 DP10 ～ 24、DP36 ～ 50 的減少，使熱漿黏度 ( HPV) 、峰值黏度( PKV) 、冷膠黏度( CPV) 和消減值 ( SBV) 極顯著提高，崩解值( BDV) 和回復值( CSV) 極顯著降低。

　　4 結論

　　水稻心白突變體 xb1 的直鏈淀粉含量相對野生型未有明顯改變，其糊化溫度也沒有明顯差異，進一步證實淀粉的糊化特性與直鏈淀粉含量密切相關。突變體 xb1 的支鏈淀粉分支結構中，DP6 ～ 9( 短鏈) 、DP25 ～ 35 ( 中長鏈) 的增加和 DP10 ～ 24( 中短鏈) 、DP36 ～ 50( 長鏈) 的減少，使 RVA 譜特征值均發(fā)生顯著改變，說明淀粉的粘滯特性受支鏈淀粉分支結構的影響。本研究通過分析心白突變體 xb1 的淀粉理化性質，有助于更深入了解淀粉合成、堊白發(fā)生機理，為進一步克隆該突變基因及稻米品質改良奠定堅實基礎。