隨著農業經濟的迅速發展，灌溉面積和灌溉用水量不斷增加，化肥施用量也不斷增加，由于灌溉技術落后和化肥的有效利用率較低，農田灌溉退水污染成為亟待解決的問題(曹仁林和賈曉葵，2001)。寧蒙灌區地處黃河中上游，年退水30億m3，主要污染物為氮、磷和COD，其中造成超標污染物主要為氮(張愛平等，2008)，對灌區水環境和黃河水安全構成了嚴重影響。

人工濕地利用基質-微生物-植物這個復合生態系統，具有獨特而復雜的凈化機理(潘麗娟和陽小成，2008)，與傳統的污水處理法相比具有基建、運行費用低，操作與維護簡單等優點(梁繼東等，2003)。微生物在人工濕地氮素的去除過程中發揮著關鍵作用，張列宇等(2010)認為，氨化-亞硝化-硝化-反硝化是濕地中脫氮的最主要途徑。反硝化細菌的反硝化反應則是使硝酸鹽氮重新回到大氣的主要途徑(方芳和陳少華，2010)，因此高效反硝化細菌的獲得對人工濕地的構建，解決農灌退水污染具有重要意義。

研究表明，好氧反硝化細菌克服了傳統的反硝化細菌只能在缺氧條件下進行反硝化作用的缺點，有氧生長，生長周期短，對高濃度的氮耐受力很強(Jooetal．，2005;周立祥等，2006)，好氧反硝化細菌的發現，為生物脫氮技術注入了新的活力。但是現在發現的好氧反硝化細菌為數不多(Patureauetal．，2000;黃運紅等，2007;王弘宇等，2007)，而高效的好氧反硝化細菌則更少(朱曉宇等，2009)。已發現的菌株中假單胞菌屬最為常見(李衛芬等，2011)，關于芽孢桿菌屬的報道相對較少。本研究涉及的人工濕地示范基地建在內蒙古自治區巴彥淖爾市烏拉特前旗境內，所在環境條件惡劣，鹽堿化程度較高，有關能夠適應此環境的高效好氧反硝化芽孢桿菌的研究鮮見報道。

因此，本研究在天然濕地底泥中分離出高效好氧反硝化芽孢桿菌，對其進行生物學鑒定，確定其在分類學上的地位，并在實驗室條件下對細菌反硝化特性進行系統的研究，充分認識濕地系統優勢好氧脫氮芽孢桿菌的脫氮特性，為今后工程實踐及強化微生物脫氮技術提供參考。

1材料與方法

1.1樣品來源

2010年6月采自內蒙古巴彥淖爾市烏梁素海底泥，風干，保存于紙袋中。

1.2培養基

菌株分離培養基(NA):牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。硝酸鹽還原產氣培養基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。種子培養基:葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4•7H2O0.5g，(NH4)2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸鈉3.32g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。反硝化基礎培養基:KNO32g，MgSO4•7H2O1g，KH2PO40.5g，葡萄糖10g，pH7.2～7.4，蒸餾水1000mL。菌株生理生化鑒定培養基參照文獻的方法(東秀珠和蔡妙英，2001)。

1.3芽孢桿菌的分離

稱取1g樣品放入裝有9mL無菌水的試管中，80℃水浴20min，充分振蕩混勻，取1mL到下一個同樣的試管中，依次稀釋得到各種濃度的菌懸液。分別取10－5～10－73個稀釋梯度的稀釋液0.1mL涂布于NA平板上，然后倒置于37℃培養箱中培養24h。挑取不同形態的單菌落轉接至NA斜面上，37℃恒溫培養24h，置于4℃冰箱保存備用。所挑取菌落同時在NA培養基平板上劃線檢驗純度。

1.4反硝化芽孢桿菌的篩選

將1.3分離得到的菌株進行硝酸鹽還原試驗，具體方法參照文獻(東秀珠和蔡妙英，2001)。對于能利用硝酸鹽并且產氣的試驗菌株接種到反硝化基礎培養基，37℃，200r•min－1，搖床震蕩培養，離心取上清，測定總氮含量。根據氮含量的變化進一步確定優勢菌株。總氮的測定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法(魏復盛等，2002)。

1.5菌株TGR30的鑒定

1.5.1形態與生理生化鑒定菌株的形態學鑒定

與生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進行。

1.5.2基因組DNA的提取及16SrDNA鑒定

參考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取細菌基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。擴增引物為通用引物(Claudiaetal．，2002)，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系、擴增程序以及產物的檢測參照胡朝松等(2009)方法。純化后的PCR產物送寶瑞通生物技術(北京)有限公司測序分析。將測序結果用BLAST軟件與GenBank中已登錄的16SrRNA基因序列進行同源性比較，通過CLUSTALX和BIOEDIT等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-joining法構建系統發育樹(Sai-tou＆Nei，1987)。1.6反硝化細菌TGR30的反硝化特性測定方法

1.6.1碳源

主要考察醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、可溶性淀粉、琥珀酸鈉、甘露醇、麥芽糖、乳糖對菌株反硝化特性的影響。將不同碳源分別以2%的添加量代替反硝化基礎培養基中的葡萄糖，同時有不加碳源的培養基作對照。將試驗菌株經純培養18h后按8%的接種量加入到添加不同碳源的發酵培養基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養66h后取樣測定總氮含量。

1.6.2碳氮比

試驗中C/N均以碳源與氮源的質量比計算。反硝化基礎培養基中KNO3濃度始終為2g•L－1，添加1.6.1小節中的最優碳源，碳源添加量根據試驗調整，其他成分不變。菌株培養方法以及取樣測定方法同1.6.1。

1.6.3鹽濃度

培養基中的鹽濃度以NaCl的含量計，設0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%8個梯度，將試驗菌株經純培養18h后，按8%的接種量接入培養基中，37℃，200r•min－1搖床振蕩培養66h后取樣測定總氮含量。