移植作用機制　

干細(xì)胞分化的RPE細(xì)胞移植挽救感光細(xì)胞的確切機制尚不明，目前認(rèn)為主要是兩種機制：神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，和色素上皮細(xì)胞與感光細(xì)胞之間生理作用的恢復(fù)。實驗中移植范圍之外的修復(fù)以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)能夠延遲感光細(xì)胞凋亡，這些研究表明：可擴(kuò)散的細(xì)胞因子如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，或bFGF可能參與細(xì)胞救援，延緩視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。同時，電鏡結(jié)果表明正常細(xì)胞間連接也是阻止感光細(xì)胞凋亡的一個重要因素。在RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞，其呈六角形長入視網(wǎng)膜色素上皮層，與宿主RPE建立緊密連接，恢復(fù)感光細(xì)胞的功能，提示視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器之間正常生理作用的恢復(fù)也是作用機制之一。

人胚胎干細(xì)胞(humanEmbryonicStemCells，hESC)分化為RPE細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCells，ESC)取自哺乳動物囊胚期(人類胚胎發(fā)育過程中受精卵形成后第5天)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。ESC在體外能直接誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及RPE細(xì)胞，誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞移植后能整合進(jìn)視網(wǎng)膜，并表達(dá)感光細(xì)胞標(biāo)記物，誘導(dǎo)分化的RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下可加強宿主感光細(xì)胞的存活[16]。若直接將ESC移植入眼內(nèi)，可以在眼內(nèi)形成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樣細(xì)胞，但移植后有致瘤性，致畸胎瘤或是其他腫瘤的風(fēng)險[16]。Vugler等[17]通過誘導(dǎo)hESC分化獲得了單層的視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞。這些獲得的RPE細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)和特異標(biāo)志物的表達(dá)上符合成熟的成人RPE細(xì)胞的特征，同時在功能學(xué)上的也極其相似。而且，體內(nèi)外實驗均證實其具有吞噬感光細(xì)胞外節(jié)的功能。多項動物實驗證實hESC分化的RPE細(xì)胞移植能夠在一定程度上挽救光感受器的功能并促進(jìn)視覺功能的修復(fù)[17-19]。最近，美國FDA已批準(zhǔn)hESC分化的RPE細(xì)胞移植用于Stargardt營養(yǎng)不良和年齡相關(guān)性黃斑病變兩類疾病的臨床實驗。但是，采用hESC來源分化RPE細(xì)胞，不可避免的存在免疫排斥問題和倫理學(xué)問題。

誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(inducedPluripotentStemCell，iPSC)分化為RPE細(xì)胞：iPSC是由外源導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子，重編程體細(xì)胞，有自我更新、多向分化潛能及記憶能力等特點的一種細(xì)胞系[20]。Dennis等[21]培養(yǎng)的人iPSC和hESC都可以自發(fā)分化為RPE細(xì)胞，這兩種來源的RPE在形態(tài)和功能上十分相似，并且都類似胎兒期的RPE細(xì)胞。另外，iPSC可以避免移植過程中的免疫排斥問題和胚胎干細(xì)胞帶來的倫理問題。Carr等[22]對RCS大鼠進(jìn)行的體內(nèi)外實驗證實iPSC分化的RPE細(xì)胞移植通過吞噬作用維持感光細(xì)胞的功能，視網(wǎng)膜外核層厚度和視功能明顯增加，且改善范圍同樣超出了細(xì)胞移植的范圍，提示移植細(xì)胞激發(fā)宿主的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，與人ESC相比，人iPSC-RPE細(xì)胞移植于RCS大鼠后的排斥反應(yīng)明顯。盡管hESC和iPSC分化的RPE細(xì)胞在動物模型上被證明是有明確功能的，但同時恢復(fù)并保持RPE細(xì)胞的極性和Bruch膜結(jié)構(gòu)對于促進(jìn)其移植后長期存活和功能整合是非常必要的。要使供體RPE細(xì)胞移植后長期存活，不發(fā)生凋亡，必須緊緊貼附于健康的Bruch膜[23]。目前認(rèn)為的RPE移植的臨床適應(yīng)癥中，Bruch膜往往已經(jīng)老化或破壞了，因而降低了移植成功率。RPE細(xì)胞移植長期存活主要決定于移植的這些細(xì)胞能否逃避受體免疫排斥反應(yīng)。移植免疫排斥反應(yīng)本身還存在成瘤，感染和肝腎毒性等并發(fā)癥。自體iPSC來源的細(xì)胞移植可以避免這一問題，而使用iPSC存在的一個主要問題是原有的遺傳缺陷再次導(dǎo)入而使供體細(xì)胞也發(fā)生原始病變。

干細(xì)胞分化為感光細(xì)胞

目前對于感光細(xì)胞完全喪失的視網(wǎng)膜疾病缺乏有效的治療方法，例如視網(wǎng)膜色素變性晚期等。如果沒有感光細(xì)胞，所謂的RPE移植以及基因治療都將失去意義，因此，必須尋找途徑重建感光細(xì)胞層。感光胞是感覺神經(jīng)元，只在一個方向上與雙極細(xì)胞或水平細(xì)胞形成連接，感光細(xì)胞替換通常比其它神經(jīng)元都更直接更容易。另外，感光細(xì)胞對外源性光刺激產(chǎn)生反應(yīng)，并不需要復(fù)雜的樹枝狀突觸來產(chǎn)生傳入沖動。這些均有利視網(wǎng)膜感光細(xì)胞移植[24]。人們嘗試用各種干細(xì)胞來獲取感光細(xì)胞。Tao等[25]在體外對人的間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStemCell，MSC)進(jìn)行培養(yǎng)，并分化成感光細(xì)胞。Sakaguchi等[26]將神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemcells，NSC)移植入成體視網(wǎng)膜，部分移植細(xì)胞整合入宿主視網(wǎng)膜，但這些細(xì)胞并沒有能夠分化成為典型的視網(wǎng)膜細(xì)胞。其失敗的原因可能是NSC分化為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的過程中需要多種復(fù)雜的分子事件來引導(dǎo)，而成體視網(wǎng)膜不能夠提供誘導(dǎo)環(huán)境。2006年，Maclaren等[27]將感光細(xì)胞前體(Photoreceptorprecursors)移植到視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞能夠?qū)獯碳ぎa(chǎn)生反應(yīng)，證實供體細(xì)胞能夠整合到成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)通路，還證實了移植細(xì)胞的整合率與細(xì)胞所處的發(fā)育階段密切相關(guān)。他們認(rèn)為，最適宜于外層視網(wǎng)膜修復(fù)的供體細(xì)胞是有絲分裂后期的感光細(xì)胞。

在一定條件下，ESC可以被誘導(dǎo)成為光感受器前體細(xì)胞。體外研究表明hESC也可分化為表達(dá)感光細(xì)胞感光細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞，成為提供感光細(xì)胞的來源[28]。將hESs體外分化后移植到Crx小鼠(Lebers先天性黑?潿?錟Ｐ?，移植細(xì)胞能夠移行并整合到病變視網(wǎng)膜中并且改善小鼠的對光反應(yīng)，這些細(xì)胞能表達(dá)感光細(xì)胞的特異標(biāo)記物并且分化出了感光細(xì)胞外節(jié)樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)[29]。近年來，iPSC的研究成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域新的熱點，研究證實iPSC可誘導(dǎo)分化為感光細(xì)胞。Lamba等[30]從人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSC，經(jīng)體外培養(yǎng)，分離出感光細(xì)胞，將其移植到正常成年小鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞能夠整合到受體并表達(dá)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞標(biāo)記物。iPSC在不同的微環(huán)境和時間段，可以分化為不同的細(xì)胞。因此，可以選擇性地誘導(dǎo)其成為特異細(xì)胞用于移植。

干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinalganglioncells，RGC)　

RGC是視網(wǎng)膜及視神經(jīng)軸突的投射神經(jīng)元，視網(wǎng)膜與大腦聯(lián)系的視覺通路。干細(xì)胞分化為RGC的機制極其復(fù)雜，相應(yīng)的研究進(jìn)展較其他細(xì)胞少。它需要供體細(xì)胞移行整合入神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層分化為RGC樣細(xì)胞，而且還需要軸突長入視神經(jīng)內(nèi)并穿過髓鞘到大腦的靶區(qū)[31]。正常RGC不僅與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，還要發(fā)出軸突與視覺通路上的很多神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，因此相較于RPE或是感光細(xì)胞移植，RGC的替代治療更是個挑戰(zhàn)。ESC[32]和MSC[33]都曾被作為細(xì)胞來源用于RGC的替代治療，研究中發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞能夠移行并整合到受體視網(wǎng)膜，但最終都沒有觀察到任何功能學(xué)方面的改善。大鼠骨髓MSC經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子體外誘導(dǎo)可分化為具有RGC表型的神經(jīng)元樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后細(xì)胞間存在突觸聯(lián)系[34]。小鼠成纖維細(xì)胞來源的iPSC，分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠存活但無法整合到健康的視網(wǎng)膜中[35]。最常累及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病變是青光眼，這是一種神經(jīng)退行性疾病，其以進(jìn)行性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞喪失為特征。有文獻(xiàn)報道在青光眼的大鼠玻璃體腔內(nèi)注射骨髓MSC能夠促進(jìn)RGC的存活[33]，同樣在青光眼大鼠模型體內(nèi)腔注射少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，顯著增加了RGC的存活率，對RGC有明顯的保護(hù)作用[36]，有望成為青光眼治療的一種新的方法。