表達透明顫菌血紅蛋白對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響

　　摘要：產油酵母的油脂合成是高度耗氧的生物過程，為提高油脂合成過程中細胞利用氧氣的能力，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合到油脂高產菌株圓紅冬孢酵母的染色體中。首先構建了透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP，再通過農桿菌介導轉化的方法將其轉化至R.toruloidesNP11中，獲得重組菌株。Westernblot和CO差異光譜分析表明，透明顫菌血紅蛋白在R.toruloidesNP11中成功表達并且具有生物活性。搖瓶發酵結果表明：與出發菌株相比，在氧氣充足條件下，重組菌株NG-21的油脂產量提高了18%;在氧氣不足條件下，重組菌株NG-22的油脂產量提高了28%;在限氧和不限氧的條件下，透明顫菌血紅蛋白均能夠促進圓紅冬孢酵母的油脂積累。

　　本文源自可再生能源,2020,38(09):1143-1148.’《可再生能源》雜志，于1983年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:21-1469/TK，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：政策與管理 、研究與實驗 、實用技術等。

　　化石燃料的日益耗竭和環境問題的日益凸顯，使得人們將目光投向綠色可再生能源。作為生物柴油的原料之一，微生物油脂具有生產周期短、底物來源廣泛等優點，因而受到研究者的廣泛關注。自然界中，少數微生物可在細胞內合成并儲存超過自身細胞干重20%以上的油脂，這些微生物被稱為“產油微生物”[1]。圓紅冬孢酵母屬于紅酵母屬，其油脂積累可達細胞干重的60%以上，同時，其可以利用的底物較為廣泛，木糖、甘油、木質纖維素等廉價的原料均可被其用于油脂發酵[2,3,4]。

　　透明顫菌是一種專性好氧原核生物，其胞內表達的血紅蛋白(VHb)使其在貧氧的環境下依然能夠生存。透明顫菌血紅蛋白與氧氣的結合速率遠遠小于其與氧氣的解離速率，因此，透明顫菌能夠在胞內儲存更多的氧氣[5]。胞內儲存的氧氣可以加速胞內氧化磷酸化的效率;影響細菌胞內的Fnr,OxyR轉錄因子，從而提高胞內透明質酸、β-葡萄糖苷酶等異源蛋白的表達量;參與胞內的代謝途徑，增加胞內代謝物的產量[6,7,8,9,10]。

　　微生物油脂發酵后期，細胞密度增大，導致溶氧量不足，使得細胞生長受到抑制，胞內產物不能正常積累。提高溶氧的傳統方法有增加攪拌速率和增大通氣量，但是，這兩種方法均會增加機械力從而對細胞具有一定損傷。因此，通過基因工程技術來緩解氧氣供給不足的情況是一種行之有效的替代方法。XueSJ研究了透明顫菌血紅蛋白對菌中普魯蘭產量的影響，研究結果表明，普魯蘭的產量從72.0g/L增加至102.3g/L[11]。ZhangH的研究表明，在溶氧量為30%的3L發酵罐中，與出發菌株相比，表達vgb基因的重組菌株Yarrowialipolytica的生物量增加了27%，油脂含量增加了38.69%[12]。

　　本文嘗試通過農桿菌介導轉化的方法，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合至圓紅冬孢酵母中，并考察重組菌株在氧氣溶量不同的發酵條件下的細胞生長和油脂積累情況，為微生物油脂的工業化生產提供了實驗基礎。

　　1、材料和方法

　　1.1菌株和質粒

　　本實驗所用的菌株和質粒的信息如表1所示。

　　表1所用菌株和質粒

　　1.2工具酶和試劑

　　PrimeSTARDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性內切酶、DpnI等均購自大連TaKaRa公司;DNAMarker2KplusII購于北京全式金生物技術有限公司;質?？焖偬崛≡噭┖?、DNA膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒和其他生物試劑均購于上海生工生物工程股份有限公司，測序工作委托蘇州泓汛公司完成;其他試劑均為分析純試劑。本研究所用的引物如表2所示。

　　表2本研究所用的引物

　　1.3培養基

　　LB液體培養基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L和氯化鈉10.0g/L,pH值為7.0。

　　LB固體培養基：在LB液體培養基的基礎上加瓊脂粉15.0g/L。

　　YPD液體培養基：葡萄糖20.0g/L、酵母提取物10.0g/L和蛋白胨20.0g/L,pH值為6.0。

　　YPD固體培養基：在YPD液體培養基的基礎上加瓊脂粉15.0g/L。

　　氮源限制培養基(NL培養基)：葡萄糖70g/L、硫酸銨0.1g/L、酵母提取物0.75g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、結晶硫酸鎂1.5g/L、體積分數為1%的痕量元素儲液(結晶氯化鈣4.0g/L、結晶硫酸亞鐵0.55g/L、一水合檸檬酸0.52g/L、結晶硫酸鋅0.1g/L、結晶硫酸錳0.076g/L和100μL18M的濃硫酸)，pH值為6.0。

　　MM鹽溶液：磷酸氫二鉀2.05g/L、磷酸二氫鉀1.45g/L、氯化鈉0.15g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.066g/L、七水硫酸鐵0.00248g/L和硫酸銨0.5g/L,pH值為7.0。

　　IM誘導平板：MM鹽溶液400mL、甘油5mL、去離子水540mL、瓊脂粉20g，高壓滅菌后加入40mL1M的MES和最終濃度為200μM的乙酰丁香酮(以上為配置1L時的添加量)。培養微生物的過程中，可根據需求添加適量的抗生素。

　　1.4載體構建

　　設計含有NcoI和SpeI兩個酶切位點的引物NcoI-F和Ble-P2A-VHb-R，擴增pUC57-vgb得到NcoI-vgb-SpeI片段;將質粒pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-mcs-THSP與該片段同時進行NcoI和SpeI雙位點酶切，再連接;通過化學轉化方法將連接產物轉至大腸桿菌感受態DH5α，在含有50μg/mL的Kan的LB平板上進行篩選，挑取轉化子并測序，獲得重組載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP。

　　1.5重組菌株的構建

　　將測序正確的pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgbTHSP載體電轉化至農桿菌AGL1感受態細胞中，并在含有50μg/mL的Kan的LB平板上篩選轉化子。經菌落PCR鑒定，挑取基因型正確的重組農桿菌單克隆轉接于5mLLB液體培養基(含50μg/mL的Kan)中。同時，挑取圓紅冬孢酵母NP11接種于5mLYPD液體培養基中，兩種菌株均在溫度為30℃，轉速為200r/min的條件下培養16h。取一定量的菌液于1.5mL離心管中，于13000r/min離心30s，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌1次。用無菌蒸餾水將菌稀釋至OD600=0.6，分別吸取100μL稀釋好的農桿菌和酵母菌等量混合，涂布于IM平板濾紙載面上，并放于24℃培養箱培養2d，將濾紙轉至潮霉素抗性濃度為50μg/mL的YPD平板進行重組菌株的篩選，長出轉化子后進行遺傳穩定性驗證及基因型驗證。

　　1.6VHb表達及功能驗證

　　分別在平板上挑取出發菌株R.toruloidesNP11(簡記為NP11)與重組菌R.toruloidesNG-20,R.toruloidesNG-21和R.toruloidesNG-22(分別簡記為NG-20,NG-21和NG-22)單菌落轉接于50mLYPD液體培養基，在溫度為30℃，轉速為200r/min的條件下培養24h后，以1∶50的比例轉接于50mLYPD培養基中，在溫度為30℃，轉速為200r/min的條件下培養24h后，離心收集菌體，超純水洗2次，緩沖液(100mM的磷酸鉀溶液，pH值為7.4)洗滌1次，將其重懸于10mL上述緩沖液中至菌體冷卻;將Mini型低溫高壓破碎儀(廣州聚能納米生物科技股份有限公司)的壓力調至180MPa，然后將重懸菌體破碎3次，再于4℃，14000r/min離心30min，取2mL上清液測總蛋白濃度。由于透明顫菌血紅蛋白能夠與CO結合成絡合物，在419nm處有特異的吸收峰，因此，使用低溫高壓破碎儀破碎細胞，再低溫離心細胞破碎液并取上清液，進行CO差異光譜分析[13]。向待測蛋白樣品中連續通2min的CO，再利用Evolution220型可見分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]進行全波長(400～500nm)掃描。

　　1.7搖瓶發酵

　　將出發菌株NP11和重組菌株NG-20,NG-21和NG-22，分別劃線于YPD平板，于28℃培養箱培養24h。分別挑單克隆接種于50mLYPD培養基中，在溫度為30℃，轉速為200r/min的條件下培養24h;再將種子液分別轉接至裝有50,100mLNL液體培養基的250mL錐形瓶中，初始OD控制為0.1，在溫度為30℃，轉速為200r/min的條件下發酵至發酵液殘糖濃度小于10g/L，收集細胞稱取細胞干重，再利用酸熱法提取油脂進行后續分析。

　　1.8Westernblot分析

　　取2mL在YPD液體培養基中培養24h的NP11和3種工程菌株，于8000r/min離心5min，棄上清，再用雙蒸水清洗一遍;加入200μL細胞裂解液以及適量玻璃珠，利用FastPrep○R-24細胞破碎儀[安諾論(北京)生物技術有限公司]振蕩1min(4.0M/s)，冰浴1min，重復5次;取60μL細胞破碎之后的上清液加入20μL4×loadingbuffer,98℃處理10min，取10μL處理過的樣品上樣(8%分離膠)，15mA限流的條件下進行電泳。通過濕法轉膜，將膠上的蛋白轉移至硝酸纖維膜上(100mA限流，電泳50min);然后將膜37℃封閉1h，膜清洗液清洗3次，每次5min。一抗采用抗His-Tag單克隆抗體(購于上海碧云天生物技術有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;二抗選擇山羊抗小鼠IgG抗體(購于上海碧云天生物技術有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;添加顯色液進行顯色，使用Tanon-5200Multi全自動化學發光圖像處理系統分析(上海天能科技有限公司)Westernblot結果。

　　1.9細胞顯微觀察

　　分別取50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)發酵液發酵終點時的菌液，利用EVOS顯微鏡(北京東勝創新生物技術有限公司)進行鏡鑒，觀察出發菌株與工程菌株的細胞形態及胞內油脂積累的情況。

　　2、結果與分析

　　2.1工程菌株vgb基因型驗證

　　通過ATMT的方法將vgb整合至圓紅冬孢酵母染色體中，使用位于啟動子的上游引物GPD-795-F與位于終止子的下游引物Thsp-129-R進行基因型鑒定，結果如圖1所示。

　　圖1基因型鑒定

　　從圖1可以看出，出發菌株NP11無條帶，而3種重組菌株NG-20,NG-21和NG-22均具有預期大小的目的條帶，這表明透明顫菌血紅蛋白基因vgb已成功整合到圓紅冬孢酵母染色體上。

　　2.2透明顫菌血紅蛋白的表達及活性功能的檢測

　　Westernblot和CO差異光譜分析的結果如圖2所示。本文使用Westernblot分析VHb蛋白在重組菌株中的表達。從圖2(a)中可以看出，在工程菌株泳道中有一條清晰的VHb蛋白(VHb蛋白單體的理論大小為15.7kDa)的免疫雜交條帶，說明重組菌株可以正常合成VHb蛋白。VHb在不同的環境條件下可呈現3種不同的狀態，若向含酶溶液中鼓入CO氣體，則可形成VHb-CO復合物，在419nm處呈現特征吸收峰。為了檢測VHb在圓紅冬孢酵母中是否具有生物活性，利用CO差異光分析方法進行檢測，結果如圖2(b)所示[14]。從圖2(b)中可以看出，3個重組菌株NG-20,NG-21和NG-22在419nm處均具有吸收峰，而出發菌株NP11沒有吸收峰，3個重組菌株間的吸光度有所差別，這可能與VHb蛋白的表達量不同有關。綜上可知，透明顫菌血紅蛋白在圓紅冬孢酵母胞內成功表達并且具有一定的生物活性。

　　圖2Westernblot和CO差異光譜分析

　　2.3VHb對油脂積累的影響

　　在本研究中，為了充分驗證透明顫菌血紅蛋白對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響，將發酵液的體積分別控制在50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)，在容量為250mL的搖瓶中進行發酵，結果分別如圖3,4所示。

　　圖3發酵液的體積為50mL時，VHb對油脂積累的影響

　　圖4發酵液體積為100mL時，VHb對油脂積累的影響

　　從圖3中可以看出：在不限氧條件下，NG-20的葡萄糖消耗最少，其他重組菌株的葡萄糖消耗無明顯差異;出發菌株NP11的油脂產量為8.04g/L，油脂產率為57%,3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產量分別為8.31,9.47,8.25g/L，油脂產率分別為59%,61%,58%;與出發菌株相比，NG-21的油脂產量提高了18%。

　　從圖4中可以看出：在限氧條件下，發酵至120h之后，3種工程菌株的葡萄糖消耗速率開始快于出發菌株的消耗速率;在發酵終點時，出發菌株的生物量為11.59g/L，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的生物量分別為12.69,11.29,13.38g/L，與出發菌株相比，NG-22的生物量增加了15.40%，這表明透明顫菌血紅蛋白能夠促進細胞的生長;出發菌株的油脂產量和產率分別為5.78g/L和50%，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產量分別為7.17,5.77,7.39g/L，油脂產率分別為57%,51%,55%，與出發菌株相比，NG-22的油脂產量提高了28%。

　　2.4VHb對細胞形態的影響

　　在限氧和不限氧條件下，出發菌株和3種工程菌株在發酵終點時的細胞形態如圖5所示。

　　圖5發酵終點時的細胞形態圖

　　從圖5(a)可以看出，出發菌株和3種工程菌株的細胞相差不大，但是3種工程菌株的胞內脂滴明顯大于出發菌株。從圖5(b)可以看出，3種工程菌株的細胞均大于出發菌株的細胞，并且胞內脂滴也明顯大于出發菌株。這進一步證明了vgb基因能夠提高胞內氧氣的利用率并且促進了胞內油脂的積累及細胞生長。

　　3、討論和結論

　　在大規模發酵生產過程中，細胞密度的增加須消耗更多的氧氣，將導致發酵液溶氧量不足。透明顫菌血紅蛋白具有運輸氧氣的功能，本研究在圓紅冬孢酵母中表達密碼子優化后的vgb基因，發現在限氧和不限氧的發酵水平下，均提高了工程菌株的氧氣利用率及耐受貧氧的能力。本文的研究結果表明：在50mL的搖瓶發酵水平(不限氧條件)下，工程菌株NG-21的油脂產量提高了18%;在100mL的搖瓶發酵水平(限氧條件)下，工程菌株NG-22的油脂產量提高了28%。值得注意的是，在氧氣不足的情況下，工程菌株油脂產量的提高更為明顯，由此說明，透明顫菌血紅蛋白可以提高胞內氧氣的利用率、緩解貧氧環境下的壓力。

　　在限制氧氣和不限制氧氣條件下，VHb均能夠提高圓紅冬孢酵母細胞的氧氣利用率從而促進油脂的積累，能夠緩解因高密度發酵導致氧氣不足而造成的細胞死亡及產量下降等問題;同時，降低了機械力對細胞的損害，延長了設備的使用壽命，縮短了發酵時間，在大規模發酵過程中，具有一定的應用前景。

　　參考文獻:

　　[7]郝寧,張晉宇,陳國強.在獸疫鏈球菌中表達vgb基因HA合成基因提高透明質酸產量[J].中國生物工程雜,2005,25(6):56-60.

　　[8]鄧發軍,潘宇,常飛,等.β-葡萄糖苷酶與透明顫菌血紅蛋白在大腸桿菌中的共表達[J].生物工程學報,2018,34(3):379-388.