論文刊發(fā)論如何處理中藥龍血竭的血清

　　論文摘要：含中藥龍血竭的血清處理方法研究在供試品溶液圖譜上選取5個特征峰較明顯的成分作為檢測指標，保留時間分別為10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min，其中峰4和峰5經(jīng)驗證，確定為龍血素A(4′羥基2,4二甲氧基二氫查耳酮)和龍血素B(4′羥基2，4，6三甲氧基二氫查耳酮)[4]，峰1、2和3結構未知。由上圖可知，空白血清樣品無干擾。

　　關鍵詞：龍血竭,含藥血清,蛋白沉淀

　　引言

　　研究含中藥龍血竭的血清處理方法。方法采用適宜蛋白沉淀劑并以有機溶劑提取處理含中藥龍血竭的血清樣品，測定含藥血清的HPLC圖譜，以龍血竭溶液中5個特征成分的峰面積為對照計算提取率，確定制備含藥血清的最佳方法。結果通過乙腈沉淀蛋白，采用乙酸乙酯進行提取，可使含藥血清中龍血竭特征成分的提取率達到80%以上。結論本法可作為龍血竭含藥血清的制備方法。

　　龍血竭為傳統(tǒng)中藥,是龍舌蘭科植物劍葉龍血樹[Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen]含樹脂木材的乙醇提取物[1]。龍血竭總黃酮(sanguis draconis flavones,SDF)是從龍血竭中提取得到的主要成分[2]，包括黃酮、二氫黃酮、黃烷、查耳酮、二氫查耳酮等20多種化合物[3]。動物實驗表明，龍血竭總黃酮能對抗整體動物心肌缺血損傷[2]。本實驗將龍血竭HPLC圖譜中特征峰較明顯的5個成分的峰面積作為檢測指標(其中2個主要成分為龍血素A和龍血素B)，以龍血竭原溶液為對照計算體外加樣后提取百分率，進行血清處理方法的研究。

　　1、儀器與試劑

　　Waters高效液相色譜儀：515 HPLC泵,2487雙波長吸收監(jiān)測器,N2000雙通道色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所);TDL802B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);超聲儀(上海超聲波儀器廠);TU1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);ZH2 BLENDER渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)。

　　廣西產(chǎn)龍血竭(廣西中醫(yī)學院制藥廠提供);龍血素A、龍血素B對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);乙腈(色譜純);甲醇，乙酸乙酯，丙酮，正丁醇，乙醚，三氯甲烷，正戊醇，95%乙醇，無水乙醇，三氯醋酸，均為分析純;新西蘭大耳白兔(廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供)。

　　2、HPLC法的建立

　　2.1色譜條件

　　色譜柱：Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);保護柱：Easyguard C18 Replacement Cartridges Cat#6101;流動相：乙腈1%冰醋酸(體積比38∶62);檢測波長：280 nm;流速：1.2 mL/min。

　　2.2溶液的制備

　　取龍血素A、龍血素B對照品適量，用甲醇分別配制成每1 mL含10 μg的溶液，作為對照品溶液。

　　取廣西龍血竭，用甲醇配制成每1 mL含2 mg的溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

　　2.3線性范圍

　　將龍血素A對照品溶液分別配制成濃度為0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125 μg/mL的溶液，進樣10 μL,記錄色譜圖，進樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為：A=45 064 451m-10 379 768，r=0.999 2，線性范圍為9.25～231.25 ng。

　　同上，將龍血素B對照品溶液分別配制成濃度為0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675 μg/mL的溶液，進樣10 μL,記錄色譜圖，進樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為：A=33 227 615m-10 135 858，r=0.999 0，線性范圍為9.47～236.75 ng。

　　2.4穩(wěn)定性試驗

　　取“2.2”項下的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、24 h進行檢測，分別記錄5個特征性成分的峰面積，相應峰面積的RSD值分別為1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%，即供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

　　2.5供試品溶液HPLC圖譜

　　取“2.2”項下的供試品溶液，龍血素A、龍血素B對照品溶液及空白血清樣品，各進樣10 μL，記錄HPLC圖譜，見圖1。

　　圖1供試品溶液(A)、龍血素A對照品(B)、龍血素B對照品(C)及空白血(D)HPLC圖譜　略

　　含中藥龍血竭的血清處理方法研究在供試品溶液圖譜上選取5個特征峰較明顯的成分作為檢測指標，保留時間分別為10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min，其中峰4和峰5經(jīng)驗證，確定為龍血素A(4′羥基2,4二甲氧基二氫查耳酮)和龍血素B(4′羥基2，4，6三甲氧基二氫查耳酮)[4]，峰1、2和3結構未知。由上圖可知，空白血清樣品無干擾。

　　3、結果與討論

　　3.1提取率的計算

　　特征性成分的提取率=血清樣品中特征性成分的峰面積/供試品溶液相應成分的峰面積×100%

　　3.2血漿樣品的處理方法

　　3.2.1蛋白沉淀劑的選擇

　　實驗中發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與10%三氯醋酸會發(fā)生反應，出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，故使用常用的蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇、丙酮進行處理。

　　由兔耳緣靜脈取血約2 mL，置離心管中，加入供試品溶液1 mL，渦旋混合，分別加入各種蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇和丙酮適量，離心，取上清液，水浴揮干后精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表1。

　　表1不同蛋白沉淀劑制備含藥血清的特征峰的提取率 略

　　從表1可見，以甲醇作蛋白沉淀劑對5個特征峰的提取率均較低，丙酮次之，乙腈和無水乙醇相對高一些，但對峰3的提取率均低于50%，證明4種處理過程均無法避免血漿蛋白對藥物的吸附，無法達到理想的提取效果。

　　按上述實驗步驟，在分別加入蛋白沉淀劑后，加入與血樣同等量的乙酸乙酯，提取3次，渦旋混合，離心，取乙酸乙酯層，合并提取液，水浴揮干，精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表2。

　　從表2可見，含藥血清在使用不同蛋白沉淀劑后，通過同種有機溶媒——乙酸乙酯進行提取，可不同程度提高5個特征性成分的提取率，以無水乙醇組提高效果最不明顯，甲醇、乙腈、丙酮組均有顯著提高，且乙腈組對5個特征峰的提取率均達到80%以上。

　　表2不同蛋白沉淀劑與溶媒結合提取制備含藥血清的特征峰的提取率 　略

　　3.2.2提取次數(shù)的選擇

　　使用乙腈作為蛋白沉淀劑，加入與血樣同等量的乙酸乙酯，分別按2、3、4次進行提取，水浴揮干后精密加入1 mL甲醇，超聲溶解，0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照，計算得各成分的提取率見表3。

　　表3不同提取次數(shù)制備含藥血清的特征峰的提取率　略

　　由表3結果可見，使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次(見圖2)的效果明顯優(yōu)于提取2次，當提取次數(shù)為4次時，對各特征性成分的提取率影響則較小，再增加提取次數(shù)意義不大。

　　3.2.3提取溶劑的選擇

　　使用乙腈作為蛋白沉淀劑，采用其他種類提取溶劑如正丁醇、乙醚、氯仿對血樣進行處理。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照，計算各成分提取率見表4。

　　圖2含中藥龍血竭血清HPLC圖譜　略

　　表4不同提取溶劑制備含藥血清的特征峰的提取率　略

　　正丁醇對于峰2、4、5的提取率達到80%以上，但對峰1和3的提取率均低于75%;而乙醚和氯仿對峰3的提取率均低于50%，不及使用乙酸乙酯為提取溶劑的效果。

　　4、結 論

　　將含中藥龍血竭的血清先通過乙腈沉淀血漿蛋白，再使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次，可使龍血竭中5個特征性成分的提取率達到80%以上。本研究結果可為中藥龍血竭的體內(nèi)藥動學研究提供依據(jù)。

　　【參考文獻】

　　[1] 孫勝利，宓鶴鳴，姚慶芳，等.不同來源國產(chǎn)血竭的薄層色譜和紫外光譜鑒別[J].中草藥，2002，33(11)：1033-1034.

　　[2] 方偉蓉，李運曼，鄧嘉元.龍血竭總黃酮對動物心肌缺血的保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10(9)：1020-1024.

　　[3] 張慶云，朱輝.龍血竭研究進展[J].武警醫(yī)學院學報，2004，13(1)：69-71.

　　[4] 周志宏，王錦堯.龍血竭的化學成分研究[J].中草藥，2001，32：484-486.