鈦植入物表面生物化學改性對骨整合的影響

　　摘要背景：鈦及鈦合金因具有良好的機械性能和生物惰性等被廣泛應用于骨科植入領域。目的：綜述不同的生物分子搭載到鈦植入物表面對骨整合的影響。方法：由第一作者應用計算機以“titanium，osseointegration，biochemical modification，coating”為英文檢索詞，以“鈦，骨整合，生物化學改性，涂層”為中文檢索詞，應用計算機檢索PubMed、Web of Science、維普、萬方、中國知網數據庫中1991-2020年已發表的相關文獻，并進行篩選、歸納與總結，最終納入104篇相關文獻進行綜述。結果與結論：鈦植入體表面單一的物理和化學修飾方式主要是間接影響細胞行為，而生物分子涂層可以直接參與生物過程，這在誘導骨形成方面更有效，不僅顯著提高了骨與植入體之間早期的骨整合，還降低了因炎癥反應導致的手術失敗及假體翻修發生率。雖然鈦植入物的生物化學改性可以直接參與生物過程，但是目前還有許多問題尚待解決：生物活性物質在鈦植入體表面的長期穩定性、釋放的速率以及鈦植入物與機體細胞和組織之間的作用機制問題還需進一步研究，從而得到骨與鈦植入物之間的早期和長期的骨整合。

　　關鍵詞：鈦;植入物;骨整合;表面改性;生物化學改性;涂層;生物活性分子;成骨分化

　　車振家; 朱正清; 朱禮偉; 李友斌; 祝晨一; 黃嵐峰， 中國組織工程研究 發表時間：2021-11-26

　　0 引言 Introduction

　　創傷、關節炎、骨轉移、骨壞死、骨質疏松等骨科疾病嚴重影響人們的生活質量 [1-2]。對于這些疾病的治療，通常使用骨科內植入物，如自異體骨 [3]、關節假體、鋼板和螺釘 [4-5]。由于純鈦和鈦合金固有的生物惰性和良好的機械性能，被廣泛應用于骨科和牙科植入 [6]。據研究報道，良好的骨整合是鈦種植體與骨界面長期結合的關鍵 [7]，但鈦種植體周圍的骨形成不足是制約著它們應用的原因 [8]。為了實現更好的骨整合，各種研究都試圖對鈦種植體表面進行改良 [9]。改變表面性能 ( 如微、亞微和納米尺度的形貌和濕潤性 [10]) 和在支架表面搭載無機物等傳統的植入修飾技術，對提高成骨活性較為有限 [11-13]，這種基于物理和化學的表面修飾方式主要是間接影響細胞行為，而將生物分子固定在鈦種植體表面的生物化學改性可以直接參與生物過程，這在誘導骨形成方面更有效 [14-15]， 尤其是在骨狀況不佳的情況下 [16]。

　　目前常用的生物分子有細胞外基質蛋白 [17]、多肽 [18-19]、生長因子 [20-21]、多糖和核苷酸等 [22-24]。因此，許多研究采用種植體表面生物化學涂層的方法來促進種植體周圍骨再生，以改善骨質結構并提高種植體骨結合率。文章針對鈦種植體表面的 5 種生物化學改性對種植體周圍骨結合影響的研究現狀與進展進行綜述。

　　1 資料和方法 Data and methods

　　1.1 資料來源 由 第 一 作 者 應 用 計 算 機 以“titanium， osseointegration，biochemical modification，coating”為英文檢索詞，以“鈦，骨整合，生物化學改性，涂層”為中文檢索詞，應用計算機檢索 PubMed、Web of Science、維普、萬方、中國知網數據庫中 1991-2020 年已發表的相關文獻，并進行篩選、歸納與總結，最終納入 104 篇相關文獻進行綜述。

　　1.2 入選與排除標準納入標準：①與鈦植入物表面生物化學改性密切相關的文章;②與生物活性物質對種植體骨整合產生積極作用的文章;③同一領域的相關研究選擇近年發表的文獻。排除標準：重復性研究;相關性差及無關文章。

　　1.3 資料提取 根據檢索詞共檢索到 297 篇相關文獻，閱讀標題和摘要，按照納入及排除標準篩選后最終共納入 104 篇文獻進行分析和整理。文獻檢索流程圖，見圖 1。

　　2 結果 Results

　　2.1 細胞外基質蛋白

　　2.1.1 膠原蛋白 Ⅰ型膠原蛋白已被證明是一種生物相容性高的有機生物材料，植入后容易被宿主組織吸收 [25]，可以有效改善種植體周圍的骨重塑 [26]。SCARANO 等 [27] 先將鈦植入物進行噴砂和酸蝕處理，再將Ⅰ型膠原蛋白共價結合到經過處理的鈦植入物表面，將其植入到兔膝關節中，在第 15， 30，60 天進行組織學分析和 Micro-CT 斷層掃描，對涂覆和未涂覆膠原植入物的種植體骨結合率、骨區域內螺紋和骨區域外螺紋進行分析，結果顯示鈦種植體表面的Ⅰ型膠原蛋白提高了鈦種植體表面生物活性，并且加速了早期成骨。然而，膠原蛋白存在著動物源性膠原的免疫反應和酶的快速降解等缺點，限制了其應用 [28]。為了克服這些缺點，大多數膠原蛋白都是在交聯后使用的，目前多采用化學試劑的方式進行交聯，但這種方式所殘留的化學試劑會對細胞產生一定的毒性作用，而伽馬輻射交聯的方式可以克服這一缺點 [29]。

　　BAE等[30]通過伽馬照射將膠原蛋白交聯到植入物表面，由于交聯過程無化學試劑的參與，所以體外細胞實驗無毒性作用和化學試劑的不良反應，而且表現出較高的成骨分化和成骨基因的表達;將鈦植入物植入到小鼠脛骨模型中，對該模型進行組織學分析和 Micro-CT 斷層掃描，結果顯示出良好的骨整合能力，并且也沒有受到化學試劑的影響。

　　2.1.2 骨橋蛋白 在骨整合過程中，骨內種植體周圍的骨橋蛋白在直接成骨過程中是必不可少的。MAKISHI 等 [31] 將經過噴砂處理過的鈦種植體分別放置于骨橋蛋白基因敲除和野生的小鼠的上頜內，植入 3，5，7，28 d 后，使用免疫組化、原位雜交和電子探針纖維分析儀對標本進行分析，結果表明，骨橋蛋白缺陷干擾了直接成骨，延遲了種植體的骨整合。 FIORELLINN 等 [32] 將骨橋蛋白涂覆在等離子噴涂鈦的表面，并與未涂覆的等離子噴涂鈦進行對比，犬模型的組織形態計量學分析顯示，第 4 周時涂覆組植入物的骨 - 植入物接觸和周圍骨密度明顯高于未涂覆組，這使植入手術產生更高的可預測性，并且降低了其風險。

　　2.1.3 纖維連接蛋白 在不同的細胞外基質蛋白中，纖連蛋白已被證明能誘導良好的細胞反應 [33]，它包含多個結構域，不僅與細胞相互作用，還與其他蛋白質相互作用，介導許多細胞過程，如細胞黏附、遷移、生長和分化 [34]。不僅如此，纖連蛋白搭載在鈦表面上時還能有效支持細胞生長。 PRAMONO 等 [35] 先用噴砂機將鈦圓盤進行噴砂處理，再將人血漿纖連蛋白涂布在經過噴砂處理的鈦圓盤上，與小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 (MC3T3-E1 細胞 ) 聯合培養，發現表面涂有纖連蛋白的噴砂鈦增強了細胞的黏附和增殖;除此之外，基質礦化和堿性磷酸酶活性也明顯增強。

　　PIVERA-CHACON 等 [36] 發現使用全長纖維連接蛋白可以使鈦植入物功能化，從而顯示出良好的骨傳導能力。然而，全長纖維連接蛋白也存在一些不足，首先是其對蛋白水解、降解敏感，還可能引起免疫反應 [37];其次是可以從人血漿中的純化纖連蛋白的量很少，因此其臨床應用受到了阻礙 [38]。與此不同，GUILLEM-MARTI 等 [39] 將纖維連接蛋白重組片段組成的細胞外基質樣結構與聚乳酸共靜電紡絲，并共價結合在拋光的鈦盤上，為了克服聚乳酸的細胞黏附能力不足、提高細胞反應性，他們在納米纖維中加入了纖維連接蛋白的細胞附著位點片段，結果顯示其顯著改善了人成骨肉瘤 SaOS-2 細胞的生物反應，提高了骨結合能力。在此基礎上，GUILLEMMARTI 等 [40] 還將纖維連接蛋白肝素結合Ⅱ片段引入精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列，使 DNA 突變生成了一個新的重組蛋白片段，再通過硅烷化法共價結合在鈦盤上。一方面，這種新蛋白在鈦上固定時可以提高細胞黏附性，同時保留了細胞分化能力;另一方面，它也表現出了良好的因子結合能力。所以，這種獲得重組蛋白的新策略為設計再生醫學活性分子打開了一個新的窗口。

　　2.2 活性肽類

　　2.2.1 成骨生長肽 成骨生長肽是一種可溶性、短而線性的生長因子肽片段，在體外可直接調節細胞增殖、成骨細胞分化和基質礦化，在體內可以促進骨形成和骨折愈合。由于成骨生長肽具有良好的骨誘導活性，所以當其固定在表面和支架上時可以促進成骨細胞分化和骨生長 [41]。POLICASTRO 等 [42] 證明，成骨生長肽功能化聚苯丙氨酸基顯示了顯著的組織與支架整合能力，并能促進其成骨。MOORE 等 [43] 還發現，通過點擊化學在合成底物上梯度固定成骨生長肽可以促進 MC3T3-E1 細胞增殖。然而，目前將成骨生長肽固定在鈦種植體表面以改善骨結合的研究還尚少。

　　LAI 等 [41] 在鈦表面通過陽極氧化制備了一層直徑約 70 nm 的定向二氧化鈦納米管，然后通過聚多巴胺中間層將成骨生長肽偶聯到二氧化鈦納米管上，體外細胞培養實驗表明，成骨生長肽功能化的二氧化鈦納米管能促進成骨細胞的擴散和分化。LIU 等 [44] 將成骨生長肽與被證明可以抑制核因子 κB 激活和 c-Fos 基因表達的 N- 乙酰半胱氨酸結合 [45]，合成了多功能肽成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸，然后通過硅烷化法將多功能肽共價結合在鈦表面，將其分別與 RAW264.7 細胞和成骨細胞共同培養，體外對破骨細胞分化因子誘導破骨細胞形成的研究表明，Ti- 成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸表面可以抑制多核細胞的形成，抑制破骨細胞相關基因的表達;對成骨細胞的研究結果表明，Ti- 成骨生長肽 -N- 乙酰半胱氨酸底物能促進成骨細胞的黏附和成骨。此研究為骨科領域制備生物功能化鈦及鈦合金植入物提供了新的思路和方法。

　　2.2.2 抗菌肽 目前對種植體和骨生物材料的研究主要集中在促進種植體骨整合和誘導成骨兩個方面，而忽視了這一過程出現的免疫炎癥反應。然而，種植體放置后的早期炎癥反應和周圍的慢性炎癥反應對種植體骨整合的長期生存都是不利的 [46]，這往往導致體內和體外研究的沖突和分歧 [47]。為了改善這一現狀，近年來許多研究開始嘗試將抗菌性能納入成骨性能的評價體系 [48]，但是由于抗菌活性的有效性和生理環境協調性之間的差異，目前還沒有獲得最佳解決方案 [49]。

　　植入物表面的抗菌涂層作為一種抗菌材料在臨床研究中取得了一定的成功，該技術最大的優點是能使用的抗菌藥物種類多，控釋可行性強 [50]，例如：TAHERI 等 [51] 制備納米銀顆粒涂層，顯示出顯著的抗菌效果;BADAR 等 [52] 制備了負載環丙沙星的層狀雙氫氧化物涂層，以延長抗生素的釋放。然而在轉化應用方面，金屬顆粒和抗生素涂層在持續使用方面都有其自身的局限性，特別是耐藥細菌的產生遠遠超過了替代藥物的發展 [53]。而抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以規避抗生素的耐藥性問題 [54]，其中抗菌肽 LL-37 具有良好的抗菌特性和生物相容性，是一種理想的抗菌劑，它不僅可以殺滅細菌，還能促進血管生成和招募免疫細胞、干細胞等多種生理活動[8]，已被證實在宿主防御和損傷愈合過程中具有多效性 [55]。

　　HE 等 [56] 先將鈦種植體進行微弧氧化處理，再用聚多巴胺為中間層將抗菌肽 LL-37 連接到鈦植入物表面，最后用磷脂在最外層覆以包衣形成復合涂層，將經過不同處理的鈦表面與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌聯合培養，以驗證復合涂層的抗菌活性和抗菌率，第 6 小時的抗菌活性結果顯示，在裸鈦上培養的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形狀是完整和飽滿的，而接種在復合涂層上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都表現出明顯的形態變化，其中細菌膜變得皺縮和破碎，這表明 LL-37 的抗菌機制是破壞細菌的膜結構;第 24 小時的抗菌率結果顯示，只經過微弧氧化的鈦表面對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為 25% 和 24.6%，而經過抗菌肽 LL-37 修飾過的鈦表面對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率達到了 71.4% 和 66.7%，抗菌率的實驗結果與早期的抗菌實驗結果一致。在此基礎上，他們還將不同處理的鈦表面與骨髓間充質干細胞和成骨細胞共同培養來驗證復合涂層的生物相容性，結果顯示復合涂層組的骨髓間充質干細胞和成骨細胞的活性均未顯示出負面影響，這為制備同時具有抗菌效果和細胞相容性的抗菌鈦植入物提供了一種方法。

　　抗菌肽 LL-37 還可以顯著促進骨髓間充質干細胞的遷移和旁分泌因子的表達 [57]。HE 等 [8] 經過微弧氧化和水熱兩步處理在種植體表面沉積羥基磷灰石，再通過聚多巴胺中間層將抗菌肽 LL-37 覆以種植體表面形成復合涂層，然后再將其與骨髓間充質干細胞進行聯合培養，通過體外實驗和體內實驗得出：抗菌肽 LL-37 涂層可以誘導骨髓間充質干細胞遷移，刺激骨髓間充質干細胞發生營養反應，植入體鈦表面的顯微結構與羥基磷灰石沉積可促進間充質干細胞的成骨分化。這為通過骨髓間充質干細胞遷移來提高鈦植入體的骨整合性能提供了一種可能。

　　除抗菌肽 LL-37 外，多肽 GL13K 是存在于人體中典型的陽離子抗菌肽之一。CHEN 等 [47] 以硅烷為化學連接劑將抗菌肽 GL13K 固定在種植體鈦表面，并與 RAW264.7 細胞聯合培養，通過 ELISA 和 qRT-PCR 分別檢測了不同極化的巨噬細胞炎性、抗炎細胞因子、炎癥相關基因及抗炎基因的表達，研究表明抗菌肽 GL13K 固定的鈦表面可以調節 M1 巨噬細胞細胞因子的釋放，抑制巨噬細胞促炎因子的分泌，促進 M2 巨噬細胞抗炎因子的釋放。巨噬細胞可以由促炎極化狀態向抑炎極化狀態轉變，從而促進炎癥過程向組織愈合過程轉化，后期還可能影響骨整合。LI 等 [58] 利用氧化處理在鈦種植體表面覆以二氧化鈦納米管，通過浸泡技術把抗菌肽 GL13K 固定于表面形成復合涂層，并且在體外將其與 MC3T3-E1 細胞聯合培養，結果顯示抗菌肽 GL13K 早期可顯著促進成骨細胞附著，中早期可預防種植體感染，后期可促進骨整合。

　　2.2.3 精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列 (RGD 序列 ) RGD 序列能促進成骨細胞在骨科植入物上的黏附和增殖，并且在鈦植入物上固定有 RGD 序列的涂層已被證明具有良好的骨整合性 [59]，在體外不僅可以刺激成骨細胞的分化，還對內皮細胞的增殖和分化具有積極的作用 [60];在體內可以增加骨與種植體界面的結合程度，從而縮短種植周期，提高種植成功率 [61]。 PARFENOVA 等 [19] 用等離子體電解氧化技術在鈦表面形成無機多孔亞層，再通過雙膦酸鹽為化學連接劑，將線性 RGD 序列共價偶聯到鈦表面形成復合涂層，體外對成纖維細胞、間充質干細胞和成骨細胞樣細胞的增殖和活性進行研究，結果表明經過雙膦酸鹽連接的鈦表面會促進細胞的增殖，未修飾的鈦表面對細胞增殖無影響。然而，對于功能化的鈦植入物的體內研究還需進一步的實驗。

　　此外，不同構象的 RGD 序列固定在鈦植物表面可能對骨整合產生不同的效果。HELLER 等 [18] 采取硅烷化法將環狀 RGD 序列和線狀 RGD 序列分別共價偶聯在鈦表面，比較兩者在體外和體內對骨反應的影響，在體外將成骨細胞分別與不同鈦表面聯合培養，對其細胞黏附、增殖、分化及堿性磷酸酶和骨鈣素進行評價;在體內將不同表面處理的鈦植入兔脛骨近端，并對骨的生長參數進行分析，結果顯示：在體外，環狀 RGD 序列和線狀 RGD 序列修飾鈦組作用差異不大，但均強于未處理的鈦組;體內研究表明，在植入的第 3 周和第6 周，環狀 RGD 序列修飾組的骨與種植體結合率均高于其他組，這些發現可以前瞻性地應用于植入材料，提高植入的成功率。

　　2.3 生長因子

　　2.3.1 血小板衍生生長因子家族 血小板衍生生長因子家族主要包括血小板衍生生長因子和血管內皮生長因子，其中血小板衍生生長因子是組織修復的一個關鍵調節因子，在組織損傷后由血小板釋放，通過增加細胞的增殖和趨化性來加快愈合過程 [62]。血小板衍生生長因子在鈦表面的首次應用是在 1991 年的一項動物研究中 [63]。在此基礎上，ORTOLANI 等 [64] 發現血小板衍生生長因子與胰島素樣生長因子 1 結合后，一方面增加了種植體周圍間隙的骨填充，另一方面可有效改善兔股骨干骺端種植體周圍骨整合的能力。KIM 等 [65] 也發現，血小板衍生生長因子與骨形態發生蛋白 2 一同接種于肝素化的鈦表面可以增強成骨細胞功能和骨整合。

　　MA 等 [66] 通過陽極氧化和化學介導將血小板衍生生長因子以共價結合的方式固定在植入體鈦表面，建立了一種新型的二氧化鈦納米管表面結構，并且在大鼠股骨遠端模型中局部植入后，可以在骨髓間充質干細胞中見到骨鈣素表達的爆發，反映了經過表面修飾的鈦植入物周圍骨形成的增強。血管形成依賴于血管內皮生長因子，除了促進血管生成以外，血管內皮生長因子還可促進成骨 [67-68]。此外，血管形成還可影響骨的生理性愈合 [69]。IZQUIERDO-BARBA 等 [70] 在 Ti6Al4V 支架上涂敷含硅的羥基磷灰石 (SiHA)，并在涂層表面搭載血管內皮生長因子，體外細胞培養實驗證明，吸附血管內皮生長因子的支架可促進支架表面內皮細胞的增殖，含硅羥基磷灰石涂層的支架可促進成骨細胞的增殖;對綿羊模型的體內研究表明，在搭載血管內皮生長因子的含硅羥基磷灰石涂層支架上表現出協同作用，表現為更多的骨化和血管生成。 2.3.2 骨形態發生蛋白家族 骨形態發生蛋白家族從屬于轉化生長因子 β 超家族，在骨的創傷修復和誘導成骨細胞分化中起重要作用 [71-72]。在已知的骨形態發生蛋白家族成員中，目前研究較多的主要是骨形態發生蛋白 2，6，7 和 9，其中骨形態發生蛋白 2 是目前應用最廣泛的生長因子之一，其在骨再生過程中起著至關重要的作用。有研究表明，將合成支架與生長因子相結合后生長因子可以促進骨結合和血管的形成，能很好地愈合創傷造成的嚴重骨缺損 [73]，但由于骨形態發生蛋白 2 的半衰期短、擴散緩慢，存在短距離擴散和局部作用，其必須以可控和持續的方式攜帶和釋放 [74]。

　　TENG 等 [75] 首先采用微弧氧化技術對多孔鈦合金進行表面處理，然后通過電化學沉積將鈣(Ca)和磷(P)結合到孔隙中，用骨形態發生蛋白 2 對 Ca、P 包覆鈦進行功能化，體外實驗表明，微弧氧化 -CaP- 骨形態發生蛋白 2 可促進骨細胞的增殖、分化和礦化，形成種植體中心;此外，他們還進行了新西蘭大白兔顱骨植入實驗，結果表明種植體的固定能力增強，具有明顯促進骨愈合的潛力，同時沉積在 Ca、P 層的骨形態發生蛋白 2 釋放時間可延長至 35 d。WANG 等 [74] 首先采用微弧氧化法在鈦表面制備羥基磷灰石和二氧化鈦復合涂層，然后采用浸涂法將骨形態發生蛋白 2 包裹的殼聚糖涂層負載在鈦表面。這種復合涂層改變了鈦植入體的生物性能，提高了其抗菌性，也改善了骨形態發生蛋白 2 的釋放行為。

　　CHEN 等 [76] 通過堿和熱處理來制作多孔鈦植入物與超親水性和負電荷表面，然后通過物理吸附將帶正電荷的魚精蛋白、帶負電荷的海藻酸鹽、最外層帶正電荷的魚精蛋白在多孔鈦植入物表面制備了“三明治樣”涂層，然后利用生物功能化技術進一步固定骨形態形成蛋白 2，從而形成多孔鈦植入物 - 魚精蛋白 / 海藻酸鹽 / 魚精蛋白 - 骨形態發生蛋白 2 生物涂層，體外生物學功能及體內成骨研究結果表明，多孔鈦植入物 - 魚精蛋白 / 海藻酸鹽 / 魚精蛋白 - 骨形態發生蛋白 2 顯著改善了 MC3T3-E1 細胞的體外成骨分化，并且在體內可能通過激活整合素和骨形態發生蛋白 /Smad 信號通路來增強體內大鼠模型的骨整合。除單因子外，有些研究通過雙因子包覆在鈦種植體表面來研究骨整合的可行性。與骨形態發生蛋白 2 相比，生長分化因子 5 作為促進骨形成的生長因子較少為人所知。YANG 等 [77] 用肝素為中間涂層將骨形態發生蛋白 2 和生長分化因子 5 涂敷在種植體鈦表面，結果表明，一方面可以延長涂層的控釋時間至 30 d;另一方面，兩種生長因子包覆的鈦增強了種植體與骨界面的骨形成和骨整合。

　　骨形態發生蛋白 6 在骨愈合過程中起著重要的作用 [78]。 BRIGAUD 等 [79] 將骨形態發生蛋白 6 與纖連蛋白結合在鈦 - 羥基磷灰石表面來測試其生物活性，結果顯示纖連蛋白 - 骨形態發生蛋白 6 誘導骨整合，并與其他實驗組相比產生了最小的不良反應。除了對骨形態發生蛋白 6 單因子的研究，有實驗將骨形態發生蛋白 6 與血小板衍生生長因子雙因子涂敷在植入體表面進行研究。KECELI 等 [80] 將鈦植入物進行陽極氧化處理，用浸泡法在陽極氧化處理表面負載骨形態發生蛋白 6，再通過靜電紡絲將絲素蛋白和血小板生長因子涂敷在鈦表面，形成陽極氧化處理 - 骨形態發生蛋白 6- 血小板生長因子 - 絲素蛋白復合涂層，在體外實驗顯示，由于骨形態發生蛋白 6 和血小板衍生生長因子可控釋放的雙重作用，該涂層細胞增殖、礦化和基因表達水平均增高，但是對骨整合的更進一步影響需要通過體內實驗證明。

　　與成骨早期參與作用的骨形態發生蛋白 2 相比，骨形態發生蛋白 7 主要在骨形成的后期發揮作用 [81]。此外，骨形態發生蛋白 7 還可誘導未分化的非成骨細胞向成骨細胞轉化，并刺激已轉化的成骨細胞成熟 [82]，在體內也顯示出良好的骨再生能力 [83]。 AL-JARSHA 等 [84] 用聚丙烯酸乙酯溶液在鈦表面進行旋涂，通過物理相互作用在鈦表面形成聚丙烯酸乙酯層，再將已經暴露生長因子和整合素結合域的纖維連接蛋白特異地結合在聚丙烯酸乙酯層表面，這種方法可以用極低濃度的骨形態發生蛋白 7(25 µg/L) 使這些底物功能化，從而創造一個微環境促進人骨髓間充質干細胞向成骨分化。他們還對人骨髓間充質干細胞進行體外實驗，結果表明該復合涂層具有良好的生物相容性及晚期成骨分化的能力，這項技術開辟了局部使用極低劑量的骨形態發生蛋白7來使骨結合最大化的途徑，從而提高了種植體的可行性。

　　在骨形態發生蛋白家族中，骨形態發生蛋白 9 被認為是最具骨誘導分化能力的骨形態發生蛋白之一 [85-87]，但是目前關于骨形態發生蛋白 9 對成骨細胞和鈦之間相互作用的研究相對較少。SOUZA 等 [85] 將 MC3T3-E1 細胞與鈦共同培養，基于劑量反應實驗選擇了最適濃度的骨形態發生蛋白 9 (20 nmol/L) 來評價骨形態發生蛋白 9 對生長在鈦表面成骨細胞分化的影響，結果表明骨形態發生蛋白 9 誘導成骨細胞發育相關轉錄因子 2、骨鈣素和骨涎蛋白的高表達，并增加堿性磷酸酶活性和細胞外基質的礦化。然而，將骨形態發生蛋白 9 搭載到鈦表面的研究還需要進一步探索。

　　2.4 多糖類

　　2.4.1 核心蛋白多糖 核心蛋白多糖是一種常見的細胞外基質分子，是一種小的富含亮氨酸的蛋白聚糖，由核心蛋白和糖胺聚糖鏈組成 [88]。MOHAN 等 [89] 研究發現，核心蛋白多糖可以通過誘導成纖維細胞凋亡和調節纖維結構抑制纖維包封。此外，核心蛋白多糖在體外也能促進成骨細胞礦化。 HE 等 [90] 用聚多巴胺將核心蛋白多糖負載在鈦的表面，觀察纖維包被抑制和骨生長，體外培養成纖維細胞和成骨細胞實驗結果表明，在核心蛋白多糖修飾的表面上，一方面成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成功能明顯減弱;另一方面其還可以增強鈣沉積和堿性磷酸酶活性。這種抑制了成纖維細胞的增殖、改善了成骨細胞功能的方法，對骨科種植體的強化具有潛在的應用價值。

　　2.4.2 殼聚糖和透明質酸 殼聚糖具有良好的生物相容性、降解性和抗菌性，是一種用于骨再生的生物活性物質，并且由于殼聚糖和細胞外基質結構之間的相似性，基于殼聚糖的復合材料可以促進細胞的黏附、增殖和分化 [91]。 RASTEGARI 等 [92] 對 Ti6Al4V 進行了堿處理和殼聚糖 - 二氧化硅納米復合涂層處理，納米復合涂層不僅提高了 Ti6Al4V 合金的生物性能，還增強了基底的表面濕潤性、磷灰石形成能力、腐蝕保護、細胞活力和細胞黏附性。PALLA-RUBIO 等 [93] 介紹了溶膠 - 凝膠法合成硅 - 殼聚糖雜化膜的方法，體外細胞培養分析表明，雜化膜對細胞無毒并能促進細胞增殖，其雜化膜中的殼聚糖不僅可以提高抗菌性，而且調節了硅的釋放，對骨再生也起著重要的作用。

　　除殼聚糖外，透明質酸也是一種天然多糖，在生物反應啟動中起著重要作用。VALVERDE 等 [94] 通過逐層沉積將透明質酸和殼聚糖搭載到 Ti6Al4V 表面，對其進行了表面改性，實驗結果表明，這種涂層不僅增加了鈦植入物的抗菌性能，也提高了植入手術的成功率。

　　2.5 核苷酸類

　　2.5.1 siRNA 核糖核酸干擾技術是一種通過沉默特定基因來調節基因表達的理想方法，被廣泛應用于靶向治療或植入物表面修飾的研究 [95]。越來越多的研究表明，功能性生物涂層如 siRNA 涂層、miRNA 涂層，可以通過促進成骨細胞的增殖、分化和黏附來改善鈦種植體的表面生物相容性 [96]。此技術不僅可以提高植入成功率、增加植入體的穩定性、改善植入體周圍軟組織的整合，還可以通過其抗菌特性減少植入體周圍的炎癥 [97]。研究發現，抑制組織蛋白酶 K 可有效抑制破骨細胞分化，增加血小板源性生長因子水平，促進成骨的血管生成 [98]。 XING 等 [95] 開發了一種新的分級納米結構，用作臨床使用的鈦植入物表面涂層，將靶向調節組織蛋白酶 K 的 siRNA 通過明膠涂覆在金納米粒子上，形成金納米粒子 -siRNA- 抑制組織蛋白酶 K，再將修飾過的金納米粒子再一次通過明膠逐層沉積構建在鈦種植體表面上，產生功能化納米粒子的多層結構，植入體 - 骨界面上 siRNA- 抑制組織蛋白酶 K 修飾的金納米粒子的受控釋放使得基因沉默過程更加精確，不僅用于抑制破骨細胞分化，還用于刺激血管生成和成骨。

　　siRNA 還能調節炎癥反應，在炎癥因子中最有效的是腫瘤壞死因子 α，它在局部參與了骨關節炎中軟骨的損傷，并且血清中腫瘤壞死因子 α 水平可用于提示骨關節炎的進展。 WANG 等 [99] 通過對鈦表面進行陽極氧化處理和殼聚糖 / 三聚磷酸鹽 - 透明質酸鈉納米顆粒將 siRNA 負載在植入體鈦表面，形成殼聚糖 / 三聚磷酸鹽 - 透明質酸鈉 -siRNA 納米顆粒，實驗建立了小鼠間充質干細胞和小鼠單核細胞系 RAW264.7 細胞的間接共培養體系，將預先激活的 RAW264.7 細胞置于 transwell 小室的上室，將 siRNA 修飾的植入鈦置于下室，以評估 siRNA 對腫瘤壞死因子 α 的調控以及對成骨分化的影響，研究證實，活化 RAW264.7 細胞分泌的腫瘤壞死因子 α 可顯著影響間充質干細胞的成骨分化，通過 siRNA 修飾的鈦表面腫瘤壞死因子 α 遠距離下調，炎癥因子解除后骨髓間充質干細胞的成骨分化得到改善。siRNA 是不穩定的生物活性物質，其應用仍然有限。siRNA 的應用需要有效的遞送系統和載體，如用于遞送 siRNA 的納米顆粒等。通過負載 siRNA 進行表面修飾后，鈦及其合金可以促進相關成骨細胞或干細胞的附著和成骨分化，并促進相關成骨標記物的表達 [23, 100]。

　　2.5.2 miRNA miRNAs 是內源性非編碼單鏈 RNA，長度約為 22 個核苷酸，在細胞發育、增殖、分化、凋亡和信號轉導等多樣的基礎生物學過程中發揮重要作用。miRNAs 模擬自然分化途徑，并控制多個基因，構成一個更完善的干細胞分化刺激因子。近年來，關于 miRNAs 對成骨的調控作用的報道不斷增多 [101]，其中 miR-138 被報道為間充質干細胞成骨分化的負調控因子，Anti- miR-138 抑制內源性 miR-138 水平可增強體內的骨形成 [102]。 WU 等 [16] 將殼聚糖 -AntimiR-138 配合物和透明質酸鈉作為帶正電荷和負電荷的聚電解質，采用分層方法制備聚電解質多層膜，再通過硅烷化法將聚電解質多層膜共價結合在經過微弧氧化的鈦表面，體外轉染結果顯示殼聚糖 -AntimiR-138 納米顆粒被細胞有效吸收，并導致 miR-138 顯著下調，但未顯示出顯著的細胞毒性，殼聚糖-AntimiR-138/ 透明質酸鈉聚電解質多層膜表面增強了間充質干細胞的成骨分化和堿性磷酸酶、膠原生成和細胞外基質礦化，在大鼠模型中觀察到體內骨結合顯著增強。這種新型 miRNA 功能化鈦種植體可用于臨床，以實現更有效、更穩定的骨整合。此外，miR-21 也已被證明與骨骼發育有關，參與多種細胞功能的調節 [103]。GENG 等 [104] 將鈦種植體依次通過酸處理、鍶磷灰石沉積和 miR-21 納米膠囊固定進行改性，這種涂層不僅能促進血管生成因子 CD31 的表達，還能增強成骨細胞基因的表達，從而促進成血管和成骨。

　　3 小結與展望 Conclusions and prospects

　　綜上所述，鈦種植體表面的生物化學改性已經成為提高種植體骨整合的有效方法，相關研究受到了廣泛關注。目前的研究結果表明，種植體表面的生物化學改性主要是將細胞外基質蛋白、活性肽類、生長因子類、多糖類和核苷酸類 5 種生物活性物質搭載在植入體表面，實現了植入體生物表面活化。

　　鈦或鈦合金植入物經過微弧氧化、噴砂、酸蝕、水熱法、等離子噴涂、電化學沉積等物理或化學改性的方法在植入物表面制備氧化膜或者粗糙表面，這種理化改性可以改變鈦或鈦合金植入物表面的濕潤度、親水性、電荷、形貌等，也為生物活性分子的搭載提供了條件。同時，在此基礎上將二氧化鈦納米管、鈣磷涂層、羥基磷灰石、明膠、殼聚糖、肝素或聚多巴胺等作為載體，通過靜電紡絲、簡單涂敷、物理吸附、硅烷化法或層層自組裝技術等不同方法將生物活性分子搭載到鈦植入物表面，使其在骨與鈦植入物之間形成一層具有一定生物活性的涂層。通過這些方法將細胞外基質蛋白、活性肽、生長因子、多糖和核苷酸搭載到鈦植入物表面，直接參與生物過程的生物化學改性主要有 3 個方面的優勢：①首先，比單一的物理和化學改性具有更高的仿生性和更確切的成骨效果;②其次，在體外細胞學評價中生物活性分子可以直接調節成骨細胞的黏附、增殖、遷移和分化，并增加堿性磷酸酶活性和細胞外基質的礦化，且進一步的分子和基因水平顯示，活化的鈦植入物可以誘導細胞發育相關轉錄因子 2、骨鈣素和骨涎蛋白等成骨相關基因的表達;纖維連接蛋白還展現出了良好的因子結合能力，成骨生長肽除了促進成骨細胞的黏附和成骨外，還可以抑制破骨細胞的表達;核心蛋白多糖可以誘導成纖維細胞凋亡和調節纖維結構，從而抑制纖維包封;③最后，體內實驗的組織學及 Micro-CT 等結果顯示，經過生物化學改性的鈦植入物可以顯著提高骨與植入物的結合率，并且加速早期成骨。此外，抗菌肽和核苷酸等的修飾還可以改善骨整合過程中另一重要的炎癥反應，經過抗菌修飾的鈦植入物可以抑制植入手術的早期炎癥反應及種植體周圍的慢性炎癥，從而降低因炎癥反應引起的手術失敗和假體翻修概率，增加了手術的可預測性，降低了其風險。

　　目前要將這種鈦植入物表面的修飾技術大量應用于臨床，還有 4 個問題需要解決：首先，生物活性分子在鈦植入物表面的結合強度較低時，會導致涂層的松動或者在植入體內過程中存在涂層因摩擦而大量磨損消耗的問題;其次，生物活性分子搭載后的完整性、微觀結構和天然構象是否發生了改變，以及經過修飾后的鈦植入物如何在表面干燥的情況下長期保存;再者，生長因子的搭載量、釋放量、釋放率和釋放時間都難以控制，都需要進一步優化而達到適量、均一、緩慢、長期的釋放效果;最后，在鈦植入物表面搭載多種物質而制備的復合涂層中的某一種物質會存在降解問題，比如含有殼聚糖的復合涂層在殼聚糖完全降解時其抗菌性能就會消失，這樣難以維持復合涂層的長期穩定性。此外，在復合涂層的多種物質中存在著協同或者拮抗的作用，這難以控制該復合涂層中的每一種物質都達到最適的搭載量。除了這些問題，有些實驗的結果顯示出體內和體外研究結果的沖突和分歧，這都亟需深入探討。

　　隨著植入體和生物材料的不斷發展，在今后會發現更加理想的搭載方法以及生物活性物質，從而解決目前存在的問題。首先，將物理、化學和生物化學改性更加有機地結合在一起，從而使生物活性物質產生更強的附著力，降低在植入過程中因摩擦而產生的損耗;其次，在已經用生物活性分子修飾過的鈦植入物表面再覆以磷脂或其他成分的外層包衣，這不但可以維持復合涂層的完整性，還可以延長其保存時間;再者，將生物活性物質作為 3D 打印的材料，使其可以長期、穩定、均勻地釋放，從而達到植入物的長期穩定性;最后，理想的生物活性物質或涂層不但可以促進骨整合，而且還應該具有抗炎等作用，所以將具有不同作用的生物活性分子共同搭載到同一鈦植入體表面，或者通過基因水平設計出同時滿足既抗菌又可以促進成血管成骨的復合涂層。此外，還可以通過基因設計出產生靶向作用的物質，從而使整個骨整合過程更加可預測。這些理想的搭載方法以及生物活性物質，一方面可以增強種植體植入的早期和長期穩定性，另一方面可以防止種植體周圍感染，并且滿足臨床應用的可行性。然而，對于骨與植入體的生物相容性在分子甚至基因水平的研究，以及涂層對骨整合的具體調控機制等問題還需要不斷探索，早日實現種植體與骨組織之間的牢固、持久而直接的結合。