基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討“山慈菇-漏蘆”藥對(duì)治療乳腺癌作用機(jī)制

　　[摘要] 目的：應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法篩選“山慈菇-漏蘆”藥對(duì)治療乳腺癌的作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，通過體外實(shí)驗(yàn)明確其作用機(jī)制。方法：通過運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取“山慈菇-漏蘆”的主要化學(xué)成分以及相關(guān)作用靶點(diǎn);使用 GendCards 篩選乳腺癌疾病的相關(guān)靶標(biāo)基因;通過 Venn 軟件篩選出藥物與疾病的共同作用靶點(diǎn);構(gòu)建出藥物-疾病的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò);蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建;通過基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析對(duì)有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析;通過細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)(CCK-8)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：通過篩選得到“山慈菇-漏蘆”有效化學(xué)成份 7 個(gè)，有效作用靶點(diǎn) 61 個(gè)，其中作用于乳腺癌的相關(guān)靶點(diǎn) 55 個(gè)。通過 GO 富集分析共富集到條目 832 個(gè)，在生物學(xué)過程方面集中體現(xiàn)。 KEGG 通路富集分析共富集到 85 個(gè)條目，包括腫瘤抑制基因信號(hào)通路 p53，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路，人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號(hào)通路等信號(hào)通路。通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了“山慈菇-漏蘆”醇提取物可抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，與空白組，二甲基亞砜(DMSO)組(0.1% 溶劑組)相比較，給藥組 MDA-MB-231 細(xì)胞吸光度顯著降低(P<0.01)，凋亡率顯著增高(P<0.01)，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，與空白組和 DMSO 組相比較，各給藥組細(xì)胞中磷酸化(p)-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論： “山慈菇-漏蘆”醇提取物能有效抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖，并可以誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與抑制 PI3K/Akt 信號(hào)通路活化相關(guān)。

　　[關(guān)鍵詞] 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);乳腺癌;山慈菇;漏蘆;作用機(jī)制

　　王冰; 王玥; 朱仲康; 崔勇; 于嵩; 劉海興; 王旭， 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志 發(fā)表時(shí)間：2021-11-03

　　乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，有相關(guān)報(bào)告指出，2018 年全球女性乳腺癌的發(fā)病率為每 10 萬人 46.3 人，死亡為 13.0 人，近年來呈顯著上升的趨勢(shì)[1]。有相關(guān)研究指出[2]，不同分子分型的乳腺癌中，與非三陰型乳腺癌相比較，其中三陰型乳腺癌的復(fù)發(fā)及內(nèi)臟的轉(zhuǎn)移率均較高，并且生存率較低，預(yù)后較差，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而對(duì)于此類型乳腺癌的治療，采用化療易發(fā)生耐藥，并且缺少內(nèi)分泌治療靶點(diǎn)[3]。近年來，有研究表示[4]，中醫(yī)藥治療乳腺癌也取得了明顯的效果，并且越來越多的患者都在逐步積極接受中醫(yī)藥的治療。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇和漏蘆兩藥均有通過影響細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞侵襲等多個(gè)方面來達(dá)到抗乳腺癌的作用[5-7]。李秀榮教授在治療乳腺癌藥對(duì)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)中提到，山慈菇、漏蘆兩藥配伍具有明顯清熱解毒、散結(jié)抗癌的功效，并提出兩藥配伍在臨床上有顯著抗乳腺癌的功效[8]。在臨床應(yīng)用中，散結(jié)類藥物在抗乳腺癌方面效果顯著，比如臨床常用制劑乳核散結(jié)片，該制劑中的主要成分山慈菇、漏蘆被廣泛應(yīng)用在抗乳腺癌治療的方劑配伍當(dāng)中，并有顯著的效果。但目前對(duì)兩藥聯(lián)合作用并且從細(xì)胞和分子水平來系統(tǒng)地闡述其抗乳腺癌的作用機(jī)制的研究較少，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法篩選出“山慈菇-漏蘆” 藥對(duì)的有效成分，進(jìn)一步構(gòu)建“藥物-疾病”靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，并探討該藥對(duì)抗乳腺癌的相關(guān)作用機(jī)制。

　　1 資料與方法

　　1.1 藥物關(guān)鍵化合物的篩選

　　運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)檢索出山慈菇、漏蘆的主要有效化學(xué)成分，再對(duì)兩藥的化學(xué)成分進(jìn)行口服利用度(OB)以及藥物相似性(DL)篩選，設(shè)置篩選條件為 OB≥30%，DL≥18%。

　　1.2 山慈菇、漏蘆化合物關(guān)鍵靶點(diǎn)及乳腺癌靶點(diǎn)的篩選

　　利用 TCMSP 檢索山慈菇、漏蘆化合物的關(guān)鍵作用靶標(biāo)基因，利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)檢索出靶標(biāo)基因?qū)?yīng)人類基因的名稱。乳腺癌相關(guān)疾病的靶標(biāo)基因通過 GeenCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得。

　　1.3 構(gòu)建“藥物-疾病”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及可視化分析

　　利用 Venn 在線軟件選取藥物與疾病共同靶點(diǎn)，并繪制 Venn 圖，利用 Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化分析。

　　1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

　　將篩選得到的藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因?qū)?STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出靶點(diǎn)基因。

　　1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

　　將“山慈菇-漏蘆”的靶蛋白上傳到 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過分析了解“山慈菇-漏蘆”藥對(duì)的有效成分對(duì)于乳腺癌的 GO 功能，進(jìn)行 KEGG 通路分析找到相關(guān)靶標(biāo)在通路中的分布情況，直接觀察到“山慈菇-漏蘆”藥對(duì)作用于乳腺癌的主要機(jī)制途徑。

　　2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

　　2.1 材料

　　人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

　　山慈菇、漏蘆中藥飲片[天馬(安徽)國(guó)藥科技股份有限公司];胎牛血清(FBS)(Clark 公司，批號(hào) FB15015，);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen 公司，批號(hào) 25200056);DMEM 培養(yǎng)液(Hyclone 公司，批號(hào) SH30022.01B);細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)(CCK)-8 試劑盒(Solution Vazyme 公司，批號(hào) A311-01);二甲基亞砜(DMSO，美國(guó) Sigma 公司，批號(hào) D2650);Annex in V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó) Everbright Inc 公司，批號(hào) 40302ES20，);BCA 法蛋白定量試劑盒(碧云天生物科技公司，批號(hào) P0012);兔抗人磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)，磷酸化(p)-PI3K，蛋白激酶 B(Akt)，p-AKT(美國(guó) Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)分別為 ABP50495，ABP59902，4691S，4060S)。

　　AVC-4D1 型超凈工作臺(tái)(新加坡藝思高科技有限公司);HERAcell 150i 型高溫滅菌二氧化碳培養(yǎng)(美國(guó) Thermo 公司);ELX-800 型酶標(biāo)儀(美國(guó) BioTek 公司);ARIA Ⅲ型流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD 公司);WD-9413B 凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一制造廠);DYY-7C 型蛋白電泳儀(北京六一制造廠)。

　　2.2 方法

　　2.2.1 “山慈菇-漏蘆”醇提取物制備

　　稱取山慈菇 12 g，漏蘆 30 g，用粉碎機(jī)粉碎，加入 75%乙醇 500 mL，回流提取 3 次，均在沸后提取 1.5 h 左右，合并 3 次提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮成浸膏狀，置于烘箱中 60 ℃烘干至粉末狀，置于 4 ℃ 冰箱備用。實(shí)驗(yàn)開始前，首先將藥物用 DMSO 進(jìn)行溶解并震蕩，配置成含生藥質(zhì)量濃度為 10 g·L-1 的母液， DMEM 培養(yǎng)基稀釋為工作液，0.22 μm 濾膜除菌，備用。

　　2.2.2 MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)

　　將人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞株置于 37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中，并使用 DMEM 高糖培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)細(xì)胞，平均 1~2 d 進(jìn)行 1 次換液，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　2.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞消化，接種于 96 孔板，平均細(xì)胞數(shù)為 8×103 個(gè)/孔，設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組，分別為空白組，DMSO 組，低劑量組(10 mg·L-1)，中劑量組(25 mg·L-1)，高劑量組(50 mg·L-1)，將低、中、高劑量組的“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h，將培養(yǎng)液吸出后加入含 10%CCK-8 的培養(yǎng)基，2 h 后(避光孵育)，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度 A 并計(jì)算，細(xì)胞活性= (A 加藥細(xì)胞-A 空白)/(ADMSO-A 空白)×100%。

　　2.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞消化，接種于 6 孔板中，細(xì)胞數(shù)目約 1×105 個(gè)/孔，設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組，分別為空白組，DMSO 組，低、中、高劑量組，將低、中、高劑量組“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h，收集細(xì)胞后，每組加入的 Binding-Buffer 懸浮液 500 μL，依次加入 Annexin V-FITC 5 μL，Propidium Iodide 5 μL 進(jìn)行混勻，染色 15 min(室溫避光)，于 1 h 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并分析細(xì)胞的凋亡率情況。

　　2.2.5 應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè) PI3K，p-PI3K，Akt，P-Akt 蛋白的表達(dá)情況

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞消化，接種在 10.0 mm 直徑的培養(yǎng)皿中，每皿中平均細(xì)胞數(shù)量為 2×106 個(gè)，設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組，分別為空白組，DMSO 組，低、中、高劑量組，將低、中、高劑量“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h 后收集細(xì)胞，加上 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞(冰上操作)，離心，收集蛋白進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定;取等量總蛋白上樣進(jìn)行 15% SDS-PAGE，電泳條件為緩沖膠 110 V 電泳 30 min，分離膠 55 V 電泳 60 min，轉(zhuǎn)膜條件為 PVDF 膜 55 mA 恒流濕轉(zhuǎn) 120 min，封閉 60 min，PI3K，p-PI3K，Akt， P-Akt 一抗 4 ℃過夜孵育，次日滴加二抗避光室溫孵育 1 h 后 TBST 洗膜，ECL 發(fā)光后進(jìn)行圖像采集及數(shù)據(jù)分析。

　　2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)???±s 表示，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3 結(jié)果

　　3.1 “山慈菇-漏蘆”藥物有效化學(xué)成分

　　本研究基于 OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，從 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲取 7 個(gè)有效化學(xué)成分，山慈菇 3 個(gè)，漏蘆為 5 個(gè)，其中 β-谷甾醇在兩藥中均含有。見表 1。

　　3.2 藥物與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)

　　利用 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得乳腺癌相關(guān)靶共 14 630 個(gè)，將“山慈菇-漏蘆”的活性化合物對(duì)應(yīng)的 61 個(gè)藥物靶點(diǎn)與乳腺癌對(duì)應(yīng)的 14 630 個(gè)疾病靶點(diǎn)獲取交集，通過 Venn 圖的形式得到 55 個(gè)共同靶點(diǎn)。

　　3.3 “藥物-疾病”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

　　將 7 個(gè)有效成分及 55 個(gè)共同靶點(diǎn)通過 Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建山慈菇-漏蘆“藥物-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

　　3.4 藥物與乳腺癌靶蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

　　從 Venn 圖中獲得 55 個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

　　3.5 “山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的通路富集分析

　　3.5.1 GO 通路富集分析

　　通過 GO 功能富集分析共獲得 832 個(gè)條目，其中“山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因信息功能主要涉及的生物過程有細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)(cellular response to drug)，膜電位的調(diào)節(jié)(regulation of membrane potential)，對(duì)類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)，腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié) G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)等。

　　3.5.2 KEGG 通路富集分析

　　通過分析共富集到 KEGG 通路 85 條，篩選功能排名前 21 名條目，“山慈菇-漏蘆”治療乳腺癌的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)所涉及到的信號(hào)通路主要有雌激素信號(hào)通路，p53 信號(hào)通路，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路，磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號(hào)通路，人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，鈣信號(hào)通路，乳腺癌等經(jīng)典信號(hào)通路，見表 2。

　　3.5.3 “山慈菇-漏蘆”醇提取物影響人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖情況

　　與空白組，DMSO 組細(xì)胞相比，低、中、高劑量的“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用于乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h 后，3 組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01)，見表 3。

　　3.5.4 “山慈菇-漏蘆”醇提取物影響人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡情況

　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，“山慈菇-漏蘆”醇提取物作用 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h 后，與空白組，DMSO 組比較，低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.01)。(表 4，圖 6)

　　3.5.5 “山慈菇-漏蘆”醇提取物對(duì)各組細(xì)胞中 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值的影響

　　Western blot 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“山慈菇-漏蘆”醇提取物在作用 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h 后，通過與空白組， DMSO 組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞中的 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 的比值均顯著降低均明顯降低(P<0.05)。見表 5，圖 1。

　　4 討論

　　我國(guó)女性惡性腫瘤當(dāng)中發(fā)病率最高的是乳腺癌，并且患者的死亡率也是逐年增加[9]。而在乳腺癌的分型當(dāng)中，三陰型乳腺癌的死亡率占比最高，并且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，在臨床治療中也是最棘手的，激素以及靶向治療對(duì)三陰性乳腺癌的效果均不顯著，幾乎只能通過化療進(jìn)行診治[10]。此外，中醫(yī)講痰濁、熱毒等病理產(chǎn)物進(jìn)行相互搏結(jié)而產(chǎn)生“癌毒”之邪，它可以是此類型乳腺癌的病因之一，可以采用清解癌毒、通絡(luò)化痰散結(jié)的治療方法進(jìn)行治療。

　　有研究表明山慈菇、漏蘆治療乳腺癌可以取得很好的療效[11]，山慈菇性甘、涼、微辛，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒，消癰散結(jié)之功，有實(shí)驗(yàn)研究表明[12-13]，山慈菇提取液可以明顯抑制人乳腺癌 MDA?MB?231 細(xì)胞的增殖，還誘導(dǎo)其細(xì)胞的凋亡，作用機(jī)制可能是抑制了 PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化;山慈菇水煎劑也可以明顯抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，抑制癌細(xì)胞的遷移。漏蘆苦寒，歸胃經(jīng)，有清熱解毒、消癰散結(jié)、通經(jīng)下乳、舒筋通脈的功效，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，大劑量的漏蘆提取物可以發(fā)揮顯著的抑癌作用。因此兩藥配伍，具有明顯的清熱解毒、散結(jié)抗癌之功，是治療乳巖的要藥。

　　本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山慈菇、漏蘆治療乳腺癌中的有效化學(xué)成分主要有 β-谷甾醇，豆甾醇，2-甲氧基-9， 10-二氫菲-4、5-二醇，DFV，谷甾醇，甘草苷和地黃素 B。有研究報(bào)道顯示[15-16]，β-谷甾醇對(duì)肺癌、乳腺癌等有顯著作用，可以通過多種途徑發(fā)揮作用，比如細(xì)胞增殖、凋亡、周期、侵襲血管生成等。豆甾醇是一種生物活性高的天然提取物，生理功能較多，可以從抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、破壞腫瘤血管生成、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種途徑發(fā)揮對(duì)肝癌、胃癌、膽管癌的抑癌作用 [17-19]。研究結(jié)果顯示了山慈菇，漏蘆兩藥中含有的相同或不同的化合物均具有顯著的抑癌作用，因此兩藥聯(lián)合應(yīng)用可以得到更加顯著的抑癌效果。

　　通過 PPI 蛋白互作結(jié)果可以看出，經(jīng)篩選得到的主要靶點(diǎn)有 GSK3B，ESR1，CASP8 以及 MAPK14 等。 ESR1(estrogen receptor 1)為編碼 ERα 的基因，該基因若出現(xiàn)突變，常會(huì)導(dǎo)致乳腺癌內(nèi)分泌治療的耐藥，因此對(duì)該基因的監(jiān)測(cè)對(duì)乳腺癌治療以及預(yù)后會(huì)發(fā)揮很大的作用[20]。GSK3B(Glycogen synthase kinase-3 beta)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以通過作用信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等。有研究發(fā)表明[21]，GSK3B 的表達(dá)情況影響著胃癌預(yù)后的情況。半胱氨酸蛋白酶 CASP8 是一種促凋亡蛋白，參與外源性凋亡信號(hào)通路，因此，其作為一種抑癌基因，參與了諸多腫瘤的發(fā)病過程，比如肝癌[22-23]、前列腺癌[24]等。MAPK14 作為 MAPK 亞家族成員之一，通過影響腫瘤細(xì)胞的凋亡與周期等生物學(xué)特性來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，CHEN[25]等研究表明通過 MAPK14 來抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。由此可見，以上基因都參與著腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，并影響腫瘤的預(yù)后。

　　本研究通過 GO 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“山慈菇-漏蘆”抗乳腺癌的靶基因主要是通過影響細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、膜電位的調(diào)節(jié)、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié) G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等生物學(xué)功能而達(dá)到抗乳腺癌的目的。在本研究 KEGG 富集分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，“山慈菇-漏蘆”主要是通過雌激素信號(hào)通路， p53 信號(hào)通路，PI3K-Akt 信號(hào)通路等發(fā)揮抗乳腺癌的作用。雌激素信號(hào)通路可以與一些蛋白互作，可能會(huì)同 TGF-β，MAPK，Akt，NF-κB 等信號(hào)傳導(dǎo)途徑交互，最終對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等具有影響[26]。p53 是一種抑癌基因，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，上游功能的相關(guān)基因來抑制體內(nèi) p53 的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期阻滯以及凋亡。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有重要調(diào)控作用[27-28]，本研究選擇此信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)“山慈菇 -漏蘆”醇提取物可能是通過抑制 PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活對(duì)人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖起到抑制作用并促進(jìn)其細(xì)胞的凋亡。

　　本研究最后對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所分析的結(jié)果進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過“山慈菇-漏蘆”醇提取物對(duì)人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖、凋亡以及對(duì) PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)控作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)“山慈菇 -漏蘆”醇提取物可以對(duì)人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且可以誘導(dǎo)人乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡，通過抑制 PI3K/Akt 信號(hào)通路活化進(jìn)而控制乳腺癌發(fā)展。

　　綜上可見，“山慈菇-漏蘆”對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制效果有顯著優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)“山慈菇-漏蘆”對(duì)乳腺癌的部分作用靶點(diǎn)以及具體作用機(jī)制，為中醫(yī)藥抗乳腺癌多靶點(diǎn)、多途徑以及作用機(jī)制相關(guān)的研究提供了方法學(xué)借鑒，并為治療乳腺癌的臨床研究提供了理論支持和研究思路。

　　利益沖突：本文不存在任何利益沖突。