本文作者：閆琳 王曉英 郭云昌 單位：中國疾病預防控制中心營養與食品安全所

PCR-ELISA是利用了PCR技術的高敏感性、核酸探針的特異性、酶標儀直接讀取結果的客觀性等優點建立的一項技術。PCR-ELISA只需要具備PCR儀和酶標儀即可實施，且其靈敏度及特異性均較高，下面就PCR–ELISA技術及其在國內外生物醫學領域中的應用進行介紹。

1PCR-ELISA技術

聚合酶鏈反應(PCR)技術自誕生以來，在各個領域都得到了廣泛的應用。傳統對擴增產物檢測的方法主要是凝膠電泳EB熒光顯色法，以定性檢測為主，只能粗略的相對定量，靈敏度低，易產生假陰性和假陽性結果，另外EB還具有致癌性。NIEMEYER等創建了應用固相捕獲的PCR定量技術，即在PCR擴增以后借用酶聯免疫吸附試驗的原理，使用酶標抗體，通過雜固相或液相雜交來實現定量檢測［1］，被稱為PCR-ELISA，它彌補了傳統PCR檢測方法的不足。該檢測技術主要包括三個部分，分別為聚合酶鏈式反應(PCR)、擴增產物與探針的雜交及常規ELISA酶標顯色［2］。通常PCR-ELISA技術需要借助生物素-鏈酶親和素系統［3］。最初的PCR-ELISA采用夾心雜交法，包括捕獲探針，擴增產物和檢測探針，后經過改進，在PCR過程中給目的片段摻入標記物，使擴增的產物也具有檢測探針的功效，即為直接雜交法。常規的PCR-ELISA只能作為一種定性試驗，但若加入內標，做出標準曲線，也可達到定量檢測的目的。

2在生物醫學領域中的應用

2.1致病菌檢測

PCR-ELISA用于致病菌的檢測，通過PCR擴增、雜交及酶顯色放大，使得該方法具有高的敏感性和特異性，而且應用96孔微孔板，可以同時檢測多份樣本，保證了檢測的時效性和準確性，適于大量樣本的篩選。國外對PCR-ELISA技術應用于致病菌的研究開展的較早，國內這方面的報道較少。在食物樣本檢測方面，PERELL等用PCR-ELISA法，檢測205份鮮奶樣本和300份牛肉餡樣本中可編碼志賀毒素的大腸埃希菌(STEC)，檢出率分別為21%和15%，結果表明，PCR-ELISA對食品原料中STEC高致病性血清群的快速檢測有助于STEC食物中毒的危險性評估［4］。HONG等用PCR-ELISA檢測禽肉中大腸彎曲菌，空腸彎曲菌和腸炎沙門菌，針對彎曲菌的ceuE基因和沙門菌的invA基因設計特異性探針，PCR擴增后用ELISA進行檢測，比傳統的電泳檢測法敏感性提高了100～1000倍，最低可以檢測到40CFU/ml彎曲菌和200CFU/ml沙門菌［5］。作者認為PCR-ELISA是一種快速高效的用于禽肉中沙門菌和彎曲菌檢測和計數的方法。2009年，曹瑋等建立了檢測單核細胞增生李斯特菌hlyA基因的PCR-ELISA方法，并通過人工染菌牛奶樣本，對其進行驗證。結果證明該方法和細菌學上傳統培養法的檢出符合率為100%。經過12h前增菌，PCR-ELISA的檢出限為1cfu/25ml牛奶樣本，比電泳法敏感10～100倍，具有良好的敏感性，特異性和可靠性，認為這種方法將有助于提高食源性疾病的預警預報能力，增強檢測方法的準確性［6］。在環境樣本檢測方面，KUO等以大腸菌群特異的16srRNA為探針，用PCR-ELISA法檢測水樣中的典型大腸菌群，檢測時限4h，誤差率為1.4%，總大腸菌群的檢出限為5cfu/100ml水樣［7］。對比研究顯示PCR-ELISA法不論在時間，檢出限和準確度上都優于目前的傳統方法。Soheili采用PCR-ELISA方法檢測工業冷凝水中的嗜肺軍團菌，以16srRNA為目的片段，選用特異性引物進行巢氏PCR，帶有DIG標記的PCR產物和生物素標記的探針雜交，通過POD標記的抗DIG抗體在顯色反應中檢測擴增產物。實驗共檢測了5份冷凝水樣本，所有樣本培養法和PCR-ELISA都檢出陽性，與細菌培養方法相比，PCR－ELISA特異性更高，檢測速度更快，作者認為該方法適用于工業冷凝水嗜肺軍團菌污染的常規檢測［8］。在致病菌臨床樣本檢測方面，YAM等用單管生物素化的巢氏PCR-ELISA法，共檢測659例結核桿菌的H37RvDNA，敏感性為97%，特異性為100%。對H37RvDNA進行系列稀釋，當A405=0.6時，該方法的檢出限為0.75cfu/每反應。結果表明PCR-ELISA是一種敏感性高、成本低廉的分子診斷方法，適用于結核病發病率高的發展中國家的臨床診斷［9］。MOUSAVI等通過PCR擴增獲得編碼霍亂毒素B亞基的基因，采用PCR-ELISA法快速篩查伊朗南部產毒的霍亂弧菌O1菌株。結果表明，該方法具有較好的特異性和敏感性。檢測限為0.5pg基因組DNA/每反應，即相當于5個菌細胞/每反應。實驗證明PCR－ELISA檢測霍亂弧菌O1菌株毒素基因更加快速和簡便［10］。

2.2轉基因食品檢測

目前國外已經開發出用于檢測轉基因食品的PCR-ELISA試劑盒，我國也已建立了轉基因食品(如大豆，水稻，魚)的PCR-ELISA檢測法。雷勃鈞等用PCR-ELISA法對大豆品種進行了轉基因的定性檢測，靈敏度高達0.1%［11］，足以達到歐盟1%檢測閾值的要求。歐盟利用PCR技術對轉基因玉米和大豆的35S啟動子和NOS終止子進行水平測試時，檢測靈敏度達到1%［12］，而利用PCR-ELISA法對轉基因大豆的檢比歐盟推薦PCR方法提高5～10倍。陳茹等先針對轉基因魚中mMT啟動子和hGH基因建立了Dig－PCR-ELISA方法，5μlPCR產物經1000倍稀釋仍可以檢測出，與常規PCR－電泳檢測方法相比敏感性可提高至100～1000倍［13］。后來又針對轉基因水稻中普遍存在的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和胭脂堿合成酶NOS終止子(Tnos)，建立了Dig–PCR-ELISA檢測方法，可檢測含量僅為0.1%的轉基因樣品，實現了半定量檢測［14］。LAETITIA等以35S啟動子或Bt176特異結合序列為目的片段的PCR-ELISA法篩選和檢測面粉和淀粉類食物中的轉基因Bt176玉米。結果表明這種方法是非常特異的，其敏感度和southern雜交相當，至少是凝膠電泳的6倍。用它來檢測Bt176、Bt11、Mon810轉基因玉米和抗草甘膦轉基因大豆，靈敏度可以達到0.1%。作者認為PCR-ELISA是篩選鑒定面粉和天然淀粉中轉基因Bt76玉米的一種可選方法，比起實時PCR更加便宜，在實驗室監測中是非常有用的［15］。綜上所述，在不同的轉基因食品中用PCR-ELISA法，檢測的靈敏度都達到了0.1%，遠遠超過了凝膠電泳法，超越倍數最高可達1000倍。

2.3病毒檢測

目前國內外應用PCR-ELISA技術檢測的病毒主要有肝炎病毒、腸病毒及禽流感病毒等。李稻等采用液相雜交技術，簡化核酸雜交過程，建立乙肝病毒(HBV)PCR-ELISA方法，檢測靈敏度達1×104拷貝/ml，大三陽標本的檢出率為97.1%，小三陽標本的檢出率為67.7%。故作者認為使用該技術可使實驗操作簡便、快速，適合臨床實驗室應用［16］。2006年，CHAHARAEIN等建立RT－PCR-ELISA法檢測禽流感病毒亞型H9N2。對H9N2接種雞的導管拭子樣本連續稀釋，用PCR-ELISA和傳統的病毒細胞培養分離法分別進行檢測，結果表明兩者的檢出限相似，并且PCR-ELISA法比PCR凝膠電泳法敏感性至少高10倍，因此作者認為該方法可用于檢測雞群中A型流感病毒，特別是H9N2亞型［17］。