作者：王特樟 李宏吉 郭靜璇 王彥波 單位：浙江工商大學食品與生物工程學院海洋資源與營養生物學研究中心

現代質譜技術作為蛋白質組學支撐技術之一，在蛋白質和肽段的鑒定、定量和結構分析方面起著非常重要的作用。質譜分析進行蛋白質鑒定和序列測定的基本原理是使用電噴霧離子化和基質輔助激光解吸離子化的軟電離方法，經酶切后的蛋白質肽段或完整蛋白質帶上電荷，然后根據不同離子間的質荷比的差異來分離并確定相對質量。樣品分子進行上述方法電離時能保留整個分子，確保了完整性而不會形成碎片離子，稱為肽質量指紋圖譜（PMF）技術。PMF是一種現在運用最廣的用來鑒定2-DE分離出來的蛋白質和肽的方法，伴隨著現代質譜技術的不斷發展，其在蛋白質組學中的應用將越來越廣泛。

高效液相色譜及多維液相色譜高效液相色譜（HPLC）技術最初被用于分離蛋白質或多肽。現在，HPLC已成功應用于蛋白質組學研究中，它是基于樣品分子在固定相（柱填料）和流動相（淋洗液）間的特殊相互作用而實現樣品分離的。無須變性處理樣品，可實現上樣收集及在線分析的自動化。利用液相色譜結合電噴霧質譜（ESI-MS）而不依賴于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特異性的胰蛋白酶消化，產生的多肽由強陽離子交換柱和反相HPLC分離后經ESI-MS/MS分析。液相色譜與MS聯用，采用高速且高靈敏度的色譜分離法來代替耗時的2-DE蛋白質分離法，故其與經典的2-DE-MS法相比，具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強等優點，將會在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更進一步的應用。但由于層析填充物對許多蛋白質組分有吸附作用，且難以實現多組分蛋白質樣品的多維層析，因此僅適用于研究單一蛋白質或簡單樣品蛋白質組。多維液相色譜（MLC）則是利用與串聯質譜聯用，可以檢測低豐度肽段，是目前蛋白質組學研究最新的技術，可快速并高通量鑒定復雜蛋白質混合物。

蛋白質組學技術在畜禽動物營養學中的應用

傳統肉類生產中的飼養管理、飼料結構、飼喂方式和飼養密度在基于動物營養和飼料工業的現代肉類生產的出現后，發生了本質性的改變。同時，大規模的現代肉類生產影響到了飼養動物的生理學、行為學和生物化學過程，隨之導致了肉品品質的下降。同時生產者為了增大產量和減少疾病風險，在養殖過程中濫用抗生素等化學藥物，加劇了肉類品質的惡化。此外，為了追求提高肉類的某些性能，忽視了飼養動物的體質健康、外部形狀與內在機能的協調，生理學的平衡和整體適應性，從而導致現代肉用動物（豬和雞）對周圍環境條件的高度敏感性，最終導致了肉品的食用品質，如：色澤、風味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素殘留現象極為突出。鑒于此，對肉品品質進行評價并對其進行可能的等級標注及對其生產過程控制，對于現代肉品生產至關重要。蛋白質是肌肉組織的重要組成成分，研究表明：肉類品質研究與功能蛋白質的結構研究間密不可分，蛋白組變化可能與肉的嫩度相關。肌纖維分紅肌纖維和白肌纖維2種類型，這2種類型在代謝水平上存在著結構和功能的差異。纖維類型與肉質性狀，如：多汁性、風味和嫩度等的關系存在著很多爭議，尤其是纖維類型對肉嫩度的影響仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白質組學分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白質組樣品，這些肌肉蛋白質相對分子質量介于5000~20萬不等，pH在4~9，結果發現蛋白質組模式發生了15種顯著的變化。此后的研究中Lametsch等最終確定了可作為肉品質標記的20多種蛋白質，包括結構蛋白質（肌動蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白）和代謝酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在這些標記蛋白中，人們發現肌動蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力間存在極顯著的相關，這就清楚地表明屠宰后肌動蛋白和肌球蛋白重鏈的降解會影響肉的質量。Remignon等直接對肌肉蛋白質片段進行分析，認為蛋白質的改變很可能是導致家禽PSE肉綜合征的直接原因。Molette等研究發現火雞屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），從而使得肉品質發生改變，如：系水力下降、加工產量降低和嫩度降低等。同樣報道了糖酵解快的動物肉的系水力低，并且提取到的肌漿蛋白含量低，這表明當pH下降的速率加快時蛋白質功能發生了改變。

蛋白質組學技術在水產動物營養學中的應用

蛋白質組學方法在水產動物營養特別是魚的品質鑒定中已有應用，目前也被廣泛應用到了對蝦和海蜇等的品質控制中。隨著對魚類水產品的需求日益增長，保障和控制其安全生產具有重要的意義。在以數量增長為主的水產集約化養殖、運輸和銷售過程中，擁擠應激是常見的影響水產品食用品質的因素，解凍程序同樣深刻地影響水產的品質。近年來，蛋白質組學已被廣泛地應用到了水產品品質控制。Inger等利用2-DE技術研究新鮮的鱈魚與死后鱈魚肌肉，發現有11個蛋白質點的豐度發生了變化，其中8個蛋白質點的豐度顯著增加，后續分析表明：這些蛋白質點是肌原蛋白、肌漿蛋白和肌肉纖維等肌肉組織的分解產物。由此可見，蛋白質組學技術對評價魚肉鮮度等品質具有重要的現實意義。Kjaersgard等通過對11種不同冷凍儲存條件下對鱈魚肌肉蛋白質圖譜進行研究分析，發現不同冷凍儲存溫度對蛋白質圖譜并無顯著影響，但經過不同的冷凍儲存時間（3、6和12個月），肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構酶、醛縮酶A和2-α肌動蛋白片段等蛋白質的質量濃度發生了顯著變化，從而導致魚肉的質地和味道發生了變化。Martinez等通過研究人工養殖的鱈魚與野生的鱈魚，比較發現人工養殖的鱈魚2-DE圖上蛋白質相對分子質量在3.5萬~4.5萬間存在顯著差異。然而目前蛋白質組學技術在水產養殖和貯藏加工過程中的研究還處于起步階段，隨著相關技術的發展，將在水產動物營養中起到更加重要的作用。

前景展望

蛋白質組學技術與傳統的蛋白質研究方法不同，它著眼于一個機體或一個細胞內整體蛋白質的活動來揭示生命活動的規律。蛋白質組學技術在動物營養學中的應用目前取得了一定的進展，但是仍處在起步階段。隨著現代分析技術和相關理論的發展，畜禽和水產等動物營養學的研究已經到了分子細胞水平，動物性產品的質量安全很大程度上也依賴于現代生物技術的應用，及時全面了解和掌握蛋白質等分子的理論和技術動態，將具有重要的現實意義。研究表明：動物機體的生理病理等變化，如：生長發育、新陳代謝、免疫疾病和消化吸收等，就本質而言，與動物蛋白質的結構功能是分不開的。鑒于此，動物營養學相關研究與蛋白質組學技術相結合，從分子水平闡述各種營養素的作用機制是現代動物營養今后發展的熱點之一。隨著研究的不斷深入，操作更加簡便、重復性更好的蛋白質組學新技術和新方法必將在動物營養及相關動物性食品安全生產中扮演舉足輕重的角色。