作者：陳葉福 李軍俠 沈世超 呂鴻雁 肖冬光 單位：工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院

培養(yǎng)基（1）YEPD培養(yǎng)基（斜面培養(yǎng)及平板純化用）：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，瓊脂20g/L，pH6.0，0.1MPa滅菌15min。（2）種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH6.0，0.1MPa滅菌15min。（3）GSH發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，酵母粉7g/L，KH2PO41g/L，K2HPO4•3H2O2.5g/L，MgSO40.1g/L，pH值自然，0.1MPa滅菌15min。

培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)從活化后的斜面上挑取一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)24h。GSH發(fā)酵種子液以10%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL三角瓶）中，28℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)22h。

鎘鹽抗性篩選向融化后的YEPD固體培養(yǎng)基中加入不同體積0.5mol/L的鎘鹽母液，制成含有不同鎘鹽濃度的梯度平板。將酵母菌株劃線于梯度平板上，30℃培養(yǎng)3d～4d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。紫外誘變育種參照參考文獻(xiàn)[6]。谷胱甘肽提取熱水抽提法[7]。谷胱甘肽生成量測(cè)定ALLOXAN試劑衍生法[8]。

正突變株與正突變將GSH產(chǎn)量或GSH胞內(nèi)含量較原株有顯著提高（提高幅度大于5%）的突變株定義為正突變株，相應(yīng)的突變?yōu)檎蛔儭?結(jié)果與分析2.1發(fā)酵過(guò)程中添加鎘鹽對(duì)釀酒酵母產(chǎn)GSH的影響據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽（GSH）過(guò)程中添加微量鎘鹽可以提高GSH生成量。由于鎘離子對(duì)菌體生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的毒害作用，因此，必須確定鎘鹽添加的時(shí)間和濃度，以消除鎘鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，這樣才能準(zhǔn)確考察鎘鹽對(duì)菌體GSH生成量的影響。

發(fā)酵過(guò)程中添加鎘鹽時(shí)間的確定繪得釀酒酵母B-3發(fā)酵生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1，發(fā)酵第3h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第8h～11h，菌體生長(zhǎng)速度減慢，并緩慢進(jìn)入生長(zhǎng)衰退期。為了減少鎘鹽對(duì)酵母菌體生物量的影響，定于發(fā)酵第11h加入適量濃度的鎘鹽。

發(fā)酵過(guò)程鎘鹽添加濃度的確定釀酒酵母B-3GSH發(fā)酵第11h時(shí)，向發(fā)酵液中添加不同體積0.50mol/L的鎘鹽母液，使各發(fā)酵液中鎘鹽的最終濃度分別為0、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、5.0mmol/L、7.0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L，發(fā)酵22h后測(cè)定菌體生物量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，當(dāng)發(fā)酵液中鎘鹽濃度達(dá)到5.0mmol/L時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響比較明顯。因此，下述實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)酵過(guò)程中添加低于5.0mmol/L濃度的鎘鹽，以消除發(fā)酵過(guò)程中鎘鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

發(fā)酵第11h和第21.5h添加鎘鹽對(duì)釀酒酵母B-3GSH生成量影響釀酒酵母B-3GSH發(fā)酵第11h和第21.5h（即發(fā)酵結(jié)束前0.5h）時(shí)，向發(fā)酵液中添加不同體積的0.50mol/L鎘鹽母液，使各發(fā)酵培養(yǎng)基中鎘離子濃度為0、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、1.7mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L，發(fā)酵22h后測(cè)定GSH生成量。由圖2、圖3可知，釀酒酵母B-3GSH發(fā)酵第11h和第21.5h（即發(fā)酵結(jié)束前0.5h）分別添加2.0mmol/L和1.0mmol/L鎘鹽，GSH產(chǎn)量比沒(méi)有添加鎘鹽時(shí)分別提高了27.4%和47.3%，而胞內(nèi)GSH含量則分別提高70.1%和45.0%。結(jié)果表明，釀酒酵母GSH發(fā)酵中期和末期，添加適量的鎘鹽可以有效提高GSH產(chǎn)量。有研究表明，重金屬（如鎘、砷）可以特異性阻遏酵母硫代謝途徑中轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子Met4遍在化失活作用，從而使Met4保持轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性，增加GSH生成量以達(dá)到解除重金屬毒害的作用[10]。上述實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了添加一定濃度的鎘鹽可以提高釀酒酵母GSH生成量。但是，由于鎘鹽具有很強(qiáng)的毒性，不能在GSH發(fā)酵過(guò)程中以直接添加誘導(dǎo)GSH生成的形式達(dá)到高產(chǎn)的目的，這樣既影響GSH的下游分離與工業(yè)廢水處理，又不符合食品安全規(guī)定。因此，能否采用誘變育種方法獲得高鎘鹽抗性的釀酒酵母突變株，通過(guò)增加酵母自身的鎘鹽抗性，將這種鎘鹽誘導(dǎo)型提高GSH的生成方式轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型，在不添加鎘鹽條件下提高GSH生成量，將是下面研究的主要方向。

釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間關(guān)系的驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存有一株利用復(fù)合誘變方法，經(jīng)ZnCl2抗性平板篩選得到的一株高產(chǎn)GSH釀酒酵母突變株B-3和多株經(jīng)離子注入所得的BL系列高產(chǎn)GSH突變株，其GSH生成量均明顯高于釀酒酵母BY-14。本部分研究，以上述菌種為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)菌株GSH生成量和鎘鹽抗性比較，驗(yàn)證釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間的關(guān)系，為高鎘鹽抗性釀酒酵母突變株篩選體系的建立奠定了理論基礎(chǔ)。2.2.1釀酒酵母GSH生成量比較按照方法1.2.2，對(duì)BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分別進(jìn)行GSH發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其GSH生成量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，釀酒酵母B-3、BL17、BL19和BL31GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量均明顯高于釀酒酵母BY-14。2.2.2釀酒酵母鎘鹽抗性比較按照方法1.3.1，將釀酒酵母BY-14劃線接種于濃度分別為0、0.30mmol/L、0.35mmol/L、0.40mmol/L、0.45mmol/L、0.50mmol/L、0.55mmol/L、0.60mmol/L的鎘鹽抗性平板上，30℃培養(yǎng)3d~4d，觀察其菌落生長(zhǎng)情況。由表3可知，釀酒酵母BY-14在0.50mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱的生長(zhǎng)，而在0.55mmol/L鎘鹽抗性平板上不能生長(zhǎng)。故選擇含0.55mmol/L鎘鹽的YEPD平板作為鎘鹽抗性驗(yàn)證平板。將釀酒酵母BY-14、B-3、BL17、BL19、BL31分別劃線接種于含0.55mmol/L鎘離子的YEPD平板上進(jìn)行鎘鹽抗性驗(yàn)證，30℃培養(yǎng)3d~4d，觀察菌體生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，除菌株BY-14外，其余4株菌在含有0.55mmol/L鎘鹽的抗性平板上均生長(zhǎng)良好。實(shí)驗(yàn)表明，釀酒酵母B-3、BL17、BL19、BL31鎘鹽抗性高于BY-14。以上結(jié)果表明，釀酒酵母BY-14GSH生成量明顯低于B-3、BL17、BL19、BL31；同時(shí)，BY-14鎘鹽抗性也明顯低于其他實(shí)驗(yàn)菌株。因此，可以初步確定釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間的關(guān)系，即釀酒酵母GSH生成量越高，其鎘鹽抗性越強(qiáng)。反之，鎘鹽抗性越強(qiáng)，其GSH生成量越高是否成立，仍須實(shí)驗(yàn)予以證明。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將利用紫外誘變方法，通過(guò)鎘鹽抗性篩選獲得高鎘鹽抗性釀酒酵母突變株，如果可以獲得GSH生成量提高的正突變株，就為建立一種高產(chǎn)GSH釀酒酵母突變株的篩選方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)，也會(huì)為釀酒酵母GSH生成量與其鎘鹽抗性之間關(guān)系作出重要補(bǔ)充。

鎘鹽抗性篩選平板的確定按照方法1.3.1，將釀酒酵母B-3和M8劃線接種于含有不同濃度鎘鹽的抗性驗(yàn)證平板上，30℃培養(yǎng)3d~4d，觀察其菌落生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，釀酒酵母B-3、M8在0.20mmol/L和0.30mmol/L鎘鹽抗性平板上有較弱生長(zhǎng)，而在0.25mmol/L和0.35mmol/L鎘鹽抗性平板上不能生長(zhǎng)。故選擇含0.25mmol/L、0.35mmol/L硫酸鎘的YEPD平板分別作為釀酒酵母B-3和M8紫外誘變初篩平板。