反硝化作用是生態系統氮循環過程中一個重要的組成部分，能夠導致農田土壤氮素損失，降低土壤肥力，促進溫室氣體N2O排放。但是從生態學的角度考慮，反硝化作用能夠把生態系統固定的氮和人為活化氮以N2的形態返回到大氣氮庫中，是活性氮最終以惰性氮離開土壤、水體等內部生物循環而回到大氣的唯一自然途徑[1]。因此，反硝化過程能夠去除水體中的硝態氮，調節水體質量，平衡生物固氮輸入通量，減少活性氮對環境和氣候變化的影響。雖然有關反硝化的研究已經取得了很大進展，但是迄今為止仍然沒有一種合適的方法來量化反硝化速率[2]，主要原因有：（1）大氣和水體中氮氣的環境背景值很高，從而使得測定反硝化產生的微量氮氣存在很大困難；（2）反硝化過程具有很大的時空變異性；（3）目前所采用的方法大都是改變了底物濃度，或者破壞了樣品的物理環境，從而不能獲得真實的反硝化速率；（4）不同研究者在反硝化測定方法上缺乏交流，從而阻礙了反硝化的研究進展。因此，本文綜述了目前在陸地和水體生態系統中幾種常用的測定反硝化速率的方法，并針對這些方法的優缺點進行討論，以期為今后反硝化測定方法的進一步研究提供參考。

1目前常用的反硝化測定方法

1.1乙炔抑制法

采用乙炔抑制法來研究反硝化是基于高濃度乙炔能夠抑制硝化作用以及N2O向N2的還原[3]，從而使得N2O成為反硝化的終產物。由于N2O在大氣中的濃度很低，因此很容易測得N2O的產生量，從而間接推算出反硝化速率。乙炔抑制法主要包括箱法和土柱方法。最早使用的乙炔抑制法是向原位箱下的土壤中灌注乙炔[4,5]，但是這種方法費力，難于操作。基于這個缺點，研究者們開始采用土柱方法。土柱法包括動態土柱法和靜態土柱法，所謂動態土柱法是指使用通氣泵促使乙炔和土壤空氣在土壤大孔隙中循環，然后在2小時之內連續測定N2O的濃度變化以計算反硝化速率[6]。但是由于氣體是采用強制泵入的方式，容易導致土柱中壓力的變化，進而破壞土壤結構、影響氣體擴散。靜態土柱法則是把乙炔注入到一個密封的容器中，經過一定時間均衡后測定N2O的積累速率[7]。與動態土柱法相比，靜態土柱法不存在氣體循環過程，并可進行大量樣品測定，但是乙炔擴散進入土柱以及N2O擴散出土柱都有一定的限度[8]。用乙炔抑制法測定反硝化速率操作簡單便捷，成本低，可以進行大批量樣品的同時測定。其主要不足之處是乙炔抑制了硝化作用，當NO3-成為反硝化的限制因子時，將低估反硝化損失量[9]，從而影響測定結果的準確度。此外還存在一些其它問題：（1）在粘土或者飽和沉積物中，乙炔擴散速率很慢，對硝化作用抑制不完全[10]；（2）長期反復使用乙炔會導致反硝化微生物對乙炔的適應，將乙炔作為一種碳源，消耗乙炔，從而導致濃度降低，抑制效果下降[11]；（3）在土壤碳含量較高而NO3-濃度較低時（<10μmolL-1）可能促進N2O的還原而削弱乙炔的抑制效果[11,12]；（4）乙炔中的雜質氣體（如丙酮）會影響反硝化過程[13]。最近還有研究表明，在有氧氣存在的情況下，高濃度乙炔（大于0.1kPa）會促進反硝化產生的NO分解或者催化NO的氧化，從而低估反硝化速率[14]。雖然乙炔抑制法存在很多問題，但由于迄今為止還沒有一個令人十分滿意的測定反硝化的方法，所以這種方法仍被廣泛使用[2]。如目前對于反硝化潛勢和反硝化酶活性的測定，普遍采用的都是乙炔抑制法[13]。低濃度乙炔能夠抑制硝化作用，高濃度乙炔不僅能抑制硝化作用，還能抑制反硝化作用過程中N2O向N2的還原。因此，Kester等[15]通過向土壤中添加不同濃度的乙炔，量化了林地、草地、河水底泥中硝化作用和反硝化作用對N2O排放的貢獻。Ullah[16]采用乙炔抑制法研究了農業流域內不同利用類型土壤的反硝化能力及其影響因素，并估算了反硝化作用對流域內硝態氮的去除能力。雖然這種方法可能低估了反硝化能力，但仍使人們認識到了反硝化作用對于去除活性氮的重要作用。

1.215N同位素示蹤法

同位素示蹤法包括15N平衡差值法和15N示蹤氣體直接測量法。15N平衡差值法是基于微區試驗中不存在徑流損失，氮的當季淋洗損失又極低，而把所有的氮素損失都作為氣態損失的基礎上建立的。廖先苓等[17]把從15N微區試驗中測得的氮素總損失量扣除氨揮發損失量后作為硝化-反硝化損失量，其優點是15N的豐度和氨揮發量可準確測定，其主要缺點是測定結果是硝化和反硝化的共同氣態損失，不能區分兩個過程對氮轉化的具體貢獻[18]。此外，李振高等認為[19]微區施入的15N與土壤原有15N進行交換，土壤中氣體逸出受阻使測定值偏低，再加上氮總損失量、氨揮發量等各個環節的測定，使得最終的測定誤差很大。15N示蹤氣體直接測量法是向土壤中添加15N標記的NO3-，然后測定產生的N2和N2O的15N來量化土壤的反硝化速率[20]。這種方法出現于50年代末，80年代廣泛應用于旱地，近年來才被用于測定稻田土壤和沉積物的反硝化損失。Petersen[21]向原狀沉積物柱樣中分別加入15NO3-和15NO2-，通過測定15N2的量，不僅計算出反硝化速率，而且還量化了厭氧銨氧化對N2排放量的貢獻，并指出沉積物中銨態氮硝化產生的NO3-是反硝化的主要氮源。雖然15N示蹤氣體直接測量法也存在氣體擴散受阻、標記不均勻等缺點，但因其具有較高的靈敏度使得此種方法仍然得到了廣泛應用并推動了反硝化過程的研究。使用15N同位素示蹤技術是建立在假定施入到土壤中的15N能夠和土壤本底15N快速均勻混合的基礎上。理論上講，由于土壤結構不均一、存在擴散障礙物、生物擾動、同位素分餾等因素使得在靜態土柱中很難達到這種快速均勻混合的狀態。但Steingruber等認為[22]，同位素的非均勻混合對反硝化測定結果的影響很小，所導致的誤差不超過10%。其他研究表明[23]，即使土壤中的NO3--N標記是不均勻的，仍能對反硝化產生的N2作出準確的估計，因為非均勻混合所導致的誤差可能遠遠小于實驗系統誤差。值得注意的是，有報道指出土壤微生物傾向于利用輕質同位素，從而使得該方法低估了反硝化的發生程度[19]。此外，向氮源缺乏的生態系統中添加15N標記的NH4+、NO3-可能會增加可利用的氮源，從而高估反硝化速率，因此這種方法最好用在氮素含量較高的生態系統中[23]。

1.3N2直接量化法