安腎顆粒定性定量的質量控制方法研究

　　摘要: 目的 對安腎顆粒主要成分進行定性及定量的質量控制方法研究。 方法 TLC 法鑒別處方中蒲公英、黃柏和玉米須;采用 HPLC 法測定黃柏中鹽酸小檗堿的含量,色譜柱為 WondaSil C18 (4. 6 mm伊250 mm, 5 滋m),以乙腈-0. 1% 磷酸溶液 (28 頤 72)為流動相;檢測波長 263 nm;流速1. 0 mL/ min;柱溫21 益。 結果 TLC 法測定蒲公英、黃柏和玉米須,斑點清晰、分離效果好;HPLC 法測定鹽酸小檗堿,進樣量在 0. 01441 ~ 0. 08646 滋g 范圍內與峰面積呈良好的線性關系,r =0. 9998。 平均加樣回收率為 99. 00% ,RSD 為 1. 54 % (n=6)。 結論 本實驗方法可做為安腎顆粒的定性定量控制方法。

　　關鍵詞: 安腎顆粒; TLC 法; HPLC 法

　　本文源自《解放軍預防醫學雜志》 CAS 2020年第4期56-59,共4頁《解放軍預防醫學雜志》主要刊載環境衛生和環境監測，勞動衛生與職業健康，飲水衛生，營養與食品衛生，熱區、高原、航空、航海等特種環境醫學、以及流行醫學、微生物學、消毒學、衛生毒理學、放射醫學防護學、軍事醫學心理學等方面的文章。辟有述評、研究論著、衛生標準、文獻綜述、專題講座、調查試驗、衛生防病經驗、實驗技術、工作簡報等欄目。讀者對象為基層衛生防疫人員衛生事業管理人員，以及環境監測、勞動保護等專業技術人員。

　　原解放軍吉林省軍區門診部配制的非標準制劑安腎顆粒,由蒲公英、黃柏和玉米須等藥味組成,有補氣活血祛濕的功效,主要用于急、慢性腎小球腎炎等癥,在臨床上療效良好。 本實驗對安腎顆粒的各味主要藥材進行了定性定量方法研究,制訂后的標準可以更加有效地控制安腎顆粒的質量。

　　1 材料

　　1. 1 實驗器材 島津 HPLC( LC - 10A);超聲儀 (SB-3200);電子分析天平(CP225D,Sartotius);電子恒溫水浴鍋(XMTD)。

　　1. 2 試藥 安腎顆粒 ( 原吉林省軍區門診部, 20170610、20170611、20170612);對照品均為中檢院出品;試劑:色譜純乙腈(Mtedia);去離子雙蒸水;甲醇 AR、乙醇 AR、乙醚 AR。

　　2 安腎顆粒主要成分分析過程和結果

　　2. 1 安腎顆粒的薄層色譜鑒別

　　2. 1. 1 安腎顆粒中蒲公英測定的薄層色譜鑒別也1-2頁 取研磨過的安腎顆粒藥粉 5g,混勻,加 5% 甲酸的甲醇溶液 30mL,超聲處理 20 分鐘,濾過,濾液濃縮至 2 mL,作為蒲公英 TLC 測定的供試品溶液。 精密稱取蒲公英對照藥材 0. 5 g,加 5% 甲酸的甲醇溶液 20mL,超聲處理 20 分鐘,濾過,濾液濃縮至 2 mL,作為蒲公英對照藥材溶液。 按安腎顆粒的制劑處方,做出不含蒲公英藥材的陰性樣,精密稱取此種陰性樣適量,按本法供試品溶液制法操作,制備不含蒲公英藥材的陰性液。 照《中國藥典》2015 年版 四部 通則 0502 試驗,分別將 10 滋L 上述安腎顆粒的三種溶液,在薄層板(硅膠 G) 上點樣,用展開劑(乙酸丁酯、甲酸、水組成,比例為 7 頤 2. 5 頤 2. 5) 的上層溶液展開后晾干,在 365 nmUV 燈下檢視。安腎顆粒供試品溶液各斑點,應與蒲公英對照藥材對應斑點顯同樣顏色,陰性液無蒲公英藥材對應斑點。 (實驗條件:T:10益 RH:20% )。 蒲公英 TLC 測定實驗結果如圖 1。

　　2. 1. 2 安腎顆粒中黃柏的薄層色譜鑒別

　　取安腎顆粒藥粉 5 g,混勻,加入分析純甲醇 30 mL,超聲儀處理 20 分鐘。 使濾液中溶劑揮發完全,只剩余殘渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成黃柏 TLC 測定的供試品溶液;精密取稱黃柏對照藥材,加入分析純甲醇 30 mL,超聲儀處理 20 分鐘后,使濾液中溶劑揮發完全,只剩余殘渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成黃柏對照藥材溶液;精密取稱鹽酸小檗堿對照品,置于量程適宜的量瓶內,分析純甲醇作為溶劑,制成鹽酸小檗堿 (0. 05mg·mL-1)對照品溶液。 按安腎顆粒的制劑處方,做出不含黃柏藥材的陰性樣,精密稱取此種陰性樣適量,按本法中黃柏 TLC 測定的供試品溶液制法操作,制備不含黃柏藥材的陰性液。 照《中國藥典》2015 年版 四部 通則 0502 薄層色譜法試驗,分別將上述安腎顆粒的四種溶液各 10 滋L,在薄層板 (硅膠 G)上點樣,放于濃氨試液預飽和20 分鐘的展開缸內,用展開劑(由環己烷、醋酸乙酯、異丙醇、甲醇、水和三乙胺組成,比例為 3 頤 3. 5 頤 1 頤 1. 5 頤 0. 5 頤 1)展開后晾干,在 365 nmUV 燈下檢視。 安腎顆粒供試品溶液各熒光斑點,應與黃柏藥材及鹽酸小檗堿對應位置熒光斑點顯同樣顏色,陰性液無黃柏及鹽酸小檗堿對應熒光斑點。 (實驗條件:T:10益 RH:20% )。 實驗結果如圖 2。

　　2. 1. 3 安腎顆粒中玉米須的薄層色譜鑒別

　　取安腎顆粒藥粉 5 g,混勻,加入分析純甲醇 30 mL,超聲儀處理 20 分鐘。 使濾液中溶劑揮發完全,只剩余殘渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成玉米須 TLC 測定的供試品溶液;精密取稱玉米須對照藥材,加入分析純甲醇 30 mL,超聲儀處理 20 分鐘后,使濾液中溶劑揮發完全,只剩余殘渣后,加 2 mL 甲醇溶解制成玉米須對照藥材溶液。 按安腎顆粒的制劑處方,做出不含玉米須藥材的陰性樣,精密稱取此種陰性樣適量, 按本法中玉米須 TLC 測定的供試品溶液制法操作, 制備不含玉米須藥材的陰性液。 照《 中國藥典》 2015 年版 四部 通則 0502 薄層色譜法試驗,分別將上述安腎顆粒的三種溶液各 10 滋L,在薄層板(硅膠 G)上點樣,用展開劑(由環己烷、醋酸乙酯、甲酸組成,比例為 10 頤 1 頤 0. 1)展開后晾干,在 365 nmUV 燈下檢視。 安腎顆粒供試品溶液各熒光斑點,應與玉米須對照藥材對應位置熒光斑點顯同樣顏色,陰性液無黃柏對應熒光斑點。 ( 實驗條件: T:10益 RH:20% )。 實驗結果如圖 3。

　　2. 2 安腎顆粒中黃柏的指標成分鹽酸小檗堿的含量測定也4-5頁

　　2. 2. 1 實驗中使用的溶液 把精密稱定研細的安腎顆粒 0. 25 g 及 25 mL 甲醇加入錐形瓶中,精密稱重, 30 min 超聲波處理后冷卻,精稱,補足至原重量,續濾液作為供試液;精密稱取鹽酸小檗堿對照品與甲醇, 放置于量程適宜的容量瓶中,配成鹽酸小檗堿對照品貯備溶液(含量約50 滋g·mL-1),再取適量用甲醇制成鹽酸小檗堿對照品溶液(含量約 5 滋g·mL-1);按安腎顆粒的制劑處方,做出不含黃柏藥材的陰性樣, 精密稱取此種陰性樣適量,按前述供試液制法操作, 制備不含黃柏藥材的陰性液。

　　2. 2. 2 HPLC 儀器條件與方法研究 色譜柱 WondaSil (C18,4. 6 mm伊250 mm,5 滋m),色譜柱內溫度:21益,以 0. 1%磷酸溶液-乙腈(72 頤 28)為流動相,流動相速度設為1. 0 mL/ min,在波長263 nm 條件下進行測定。 分別取“2. 2. 1冶三種溶液各 10 滋L 進樣,結果表明樣品中待測成分分離良好,陰性對照無干擾,見圖4。

　　2. 2. 3 考察測定鹽酸小檗堿的線性關系 將“2. 2. 1冶鹽酸小檗堿對照品貯備溶液稀釋成不同濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液,各精密吸取 10 滋L,依次按 “2. 2. 2冶項條件測定,記錄峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(Y),進樣量(X) 為橫坐標,制標準曲線。結果表明,鹽酸小檗堿在 0. 01441 ~ 0. 08646 滋g 范圍內 線 性 關 系 良 好, 得 回 歸 方 程: y = 4 伊 10 6 x + 3609. 1,r = 0. 9998。

　　2. 2. 4 研究考察重復性及穩定性 取安腎顆粒 (20170611,n = 6),研細,精密稱取 0. 25 g / 份,按“2. 2. 1冶實驗供試液配制操作后,按“2. 2. 2冶 測定,結果:被測組分鹽酸小檗堿平均含量為 0. 6219 mg / g, RSD 為 0. 79 % (n = 6),故此方法重復性較好;另取重復性實驗溶液各進樣 10 滋L(時間間隔:0 小時、2 小時、4 小時、8 小時、10 小時、12 小時),結果:被測組分的峰面積積分值平均值為 250470. 5,測得峰面積值的 RSD 為 0. 46 % (n = 6),故此種測定方法穩定性比較好。

　　2. 2. 5 回收率試驗 精密稱取安腎顆粒(20170611, 鹽酸小檗堿含量為 0. 6219 mg / g)0. 4 g、0. 5 g、0. 6 g 三個梯度樣品,每個梯度 3 份,分別加入 100 mL 容量瓶中;稱取鹽酸小檗堿對照品 ( 含量:86. 7% ) 14. 70 mg,置 250 mL 容量瓶中,甲醇定容至刻度,再分別取 4. 0、5. 0、6. 0mL 對照品溶液加入上述已稱取安腎顆粒的三個梯度容量瓶中,再分別在三個梯度量瓶中加甲醇 96 mL、95 mL、94 mL,密閉,稱重。超聲處理 30 分鐘,放冷,稱重,用甲醇補足減失的重量,取過濾后的續濾液,分別按前述鹽酸小檗堿的含量測定實驗方法操作、計算(表 1)。

　　2. 2. 6 測定制劑樣品含量 取 3 批安腎顆粒制劑樣品(20170610、20170611、20170612),制備、測定方法與上項相同,計算鹽酸小檗堿的含量(表 2)。

　　3 討論與總結

　　(1)最大波長的考察。 通過 UV 法對鹽酸小檗堿對照品溶液全波長掃描,結果知 263 nm 時靈敏度最高,因此確定為此波長。 (2) 實驗中使用的溶液制備的方法確定。 考察溶媒為乙醇、不同濃度甲醇等共四種,考察結果:甲醇作為溶媒時,結果最好,因此確定其為最佳提取溶劑。 實驗考察加熱回流、超聲不同時間,四種處理方法,結果 30 分鐘超聲所測組分含量明顯高于 20 分鐘超聲和 30 分鐘加熱回流,故最佳提取方法為用甲醇超聲處理 30 分鐘。

　　(3)黃柏為安腎顆粒中主要有效組分,本實驗選擇其中指標性成分:鹽酸小檗堿,確定了其定量測定方法,線性、重復性、穩定性、回收率等定性實驗結果表明,選擇 HPLC 法作為安腎顆粒中鹽酸小檗堿含量的測定方法,操作簡便快捷,準確度好,可以作為本品質量控制方法。 (4)中國藥典及其他文獻資料中均無玉米須薄層定性鑒別,本試驗成功將玉米須的薄層鑒別方法納入標準,方法簡便,薄層斑點清晰, 重現性好,為日后研究玉米須的實驗人員提供了較好參考價值。 (5) 實驗中以乙腈-0. 1% 磷酸溶液 (28 頤 72)為流動相時,柱溫控制是關鍵,本試驗柱溫超 25益時色譜峰嚴重拖尾,最終確定柱溫為 21益時色譜峰行良好,分離度符合要求。

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