不同類型稻田亞硝酸型 CH4厭氧氧化潛力的比較研究

　　摘要：甲烷(CH4)厭氧氧化是稻田土壤中消減溫室氣體排放的重要過程。本試驗選擇內陸性南京稻田和濱海性上海崇明島圍墾稻田，比較研究稻田耕層(0～10 cm)和深層(50～60 cm)土壤中亞硝酸鹽型 CH4厭氧氧化(n-DAMO)潛力的差異及其微生物驅動機制。結果表明，南京稻田耕層土壤的 n-DAMO 速率 為 3.51 µmol 13CO2·g-1 ·d-1， 顯 著 高 于 圍 墾 稻 田 耕 層 土 壤 (1.43 µmol 13CO2·g -1 ·d-1)。兩種類型稻田耕層土壤的 n-DAMO 速率均顯著高于深層土壤。南京稻田和圍墾稻田 M. oxyfera-like 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數分別為 (2.31~4.82)×107 和(0.89~2.12)×107 copies·g -1，與亞硝酸鹽型 CH4 厭氧氧化速率顯著正相關。相關性分析發現，土壤有機碳、總氮、無機態氮是稻田 n-DAMO 速率分異的重要原因。綜上所述，內陸性稻田土壤 n-DAMO 氧化潛力較高，其主要由較高的土壤本底碳、氮水平和功能微生物豐度所致。

　　關鍵詞：圍墾稻田;厭氧 CH4氧化; M. oxyfera 細菌豐度;深層土壤

　　薛夢琪; 周聰; 饒旭東; 謝晴; 張耀鴻 南京信息工程大學學報(自然科學版)2021-12-16

　　0 引言

　　甲烷(CH4)是一種重要的溫室氣體，具有很強的紅外吸收帶，其百年時間尺度上的增溫潛力是二氧化碳(CO2)的 28～34 倍[1]，占全球變暖貢獻率的 20%[2]。稻田是主要的 CH4 排放源，每年向大氣釋放 25～300 Tg [3]，占全球甲烷排放量的 10%～20%[4-5]。氮肥的施加導致稻田產生高濃度的 NOx -，為反硝化型厭氧甲烷氧化細菌和古菌提供了理想的生境[6]。目前認為，亞硝酸型厭氧甲烷氧化(nitrite dependent Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, n-DAMO)過程由 NC10 門的 Candidatus Methylomirabilis oxyfera 細菌介導，該微生物具有內產氧功能，可單獨將 NO2 -還原，同時將 CH4氧化為 CO2。n-DAMO 過程多發生于淡水濕地[7]、湖泊生態系統[8]等，近期在海洋生態系統中也檢測到了 nDAMO 過程的存在[9]。 Wang 等[10]報道濱海潮間帶生態系統 DAMO 細菌與古菌可以共存，從而使潮間帶生態系統成為重要的 CH4匯。進一步發現 n-DAMO 過程在 CH4循環過程中起著更重要的作用。

　　濕地生態系統中 n-DAMO 細菌介導的 CH4 厭氧過程受到土壤母質、氮(N)水平、施肥、鹽分以及濕地剖面深度等因素的影響，其在稻田土壤中氧化作用表現強烈。Wang 等[10]發現在原位稻田濕地中, n-DAMO 細菌的數量與 NO3 -濃度呈顯著正相關。施入稻田的氮肥反硝化會產生 NO2 -，可以作為電子受體促進土壤厭氧微域的 n-DAMO 反應[6]。研究還發現：濕地系統不同深度土壤中 nDAMO 細菌的群落組成和活性存在明顯差異[11];一般認為，相較于表層土壤，濕地深層土壤更有利于 n-DAMO 細菌的分布和 n-DAMO 反應的發生[12]，可能是由深層土壤長期處于較穩定的缺氧狀態所致。n-DAMO 細菌群落在濱海生態系統中的分布存在較強的空間異質性，其在杭州灣和長江口濱海區中 n-DAMO 細菌的數量和活性均與土壤鹽度呈顯著負相關[13-14]，其機理尚不清楚。

　　濱海濕地處于海陸交錯帶，具有海洋性和陸地性雙重特征，當前受人類活動的影響日益嚴重。隨著經濟的發展和人口的增長，人類對土地的需求日趨迫切，濱海灘涂圍墾造田成為解決土地問題的有效途徑。圍墾后的濕地自然條件相對穩定、不再受海水潮汐的影響，形成與自然灘涂濕地明顯不同的獨特生境。在此基礎上，人工灌溉、耕作、施肥、水稻種植等農業措施加速了圍墾稻田的熟土化進程：由海洋性灘涂逐漸向陸地性農田演替，土壤的物理、化學和生物特征發生了顯著改變，但與內陸性稻田存在著明顯差別。這種圍墾植稻驅動的熟土化作用對土壤甲烷氧化過程可能會產生重要影響。那么，處于熟土化進程中的圍墾稻田，其甲烷厭氧氧化潛力有何特征?與典型內陸性稻田相比，其甲烷厭氧氧化速率變化的主控因素是什么?是否與功能微生物群落結構及數量特征之間存在內在關系?

　　鑒于此，本試驗選取兩個不同類型的稻田：微堿性 N 貧瘠的長江口崇明圍墾稻田和微酸性 N 豐富的南京稻田，研究其表層和深層土壤的 CH4厭氧氧化速率及 nDAMO 細菌的豐度，探明在土壤母質、pH 值、N 水平以及鹽分等差異較大的稻田土壤環境中，n-DAMO 反應速率及其微生物學機理，進一步闡明其分異規律，為稻田 CH4減排提供參考依據。

　　1 材料與方法 1.1 土壤樣品采集

　　本研究選取上海市崇明島東灘濕地(121.92°E，31.50°N)圍墾 16 年稻田(WK)與南京信息工程大學農業氣象試驗站(118.86°E，32.16°N)荒地改種稻 15 年稻田(NJ)。在每個稻田內以 S 形設置 6 個采樣點，各采樣點間距 15m。用土鉆取 0～60 cm 深度的土柱，取出 0～10 cm 和 50～60 cm 的土層樣品，并將相同深度的土樣充分混合，放入冰盒中帶回實驗室冷凍保存備用。

　　1.2 土壤理化性質測定

　　土壤全氮( TN) 含量采用半微量凱氏定量法測定。土壤總有機碳( TOC) 含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測定。土壤銨態氮和硝態氮含量用 2 mol/L KCl 溶液浸提后，采用 AA3 流動分析儀測定。土壤 pH 值和 EC 值分別采用數字酸度計和電導儀測定。

　　1.3 厭氧 CH4氧化速率測定

　　將 5 g 土壤樣品放入 40 mL 的培養瓶后加入 10 mL 的超純水，膠塞密封后抽真空-充氬氣重復進行 3 次，以達到嚴格厭氧狀態。室溫 25 ℃避光條件下 120 r/min 轉速預培養 2d，以盡可能去除殘余 O2 的影響。預培養結束后，再次抽真空-充氬氣 2 次，然后將每個土樣分成 3 組，分別進行底物添加處理：1) 添加 Ar;2) 添加 13CH4;3) 添加 13CH4 + NO2 -。每個處理 3 次重復。添加的 13CH4相對豐度為 99%，瓶內頂空剩余體積以氬氣補充，使得培養瓶頂空 13CH4 最終質量分數為 10%。添加的 NO2 -最終濃度分別為 0.5 mmol。全部培養瓶在室溫 25 ℃ 避光條件下 120 r/min 轉速正式培養 7d。

　　培養結束后，用氣相色譜儀-質譜儀連用法測定瓶中 13CO2 的產生量。處理 1)為對照組，如果瓶中 13CO2 的相對豐度處于自然豐度水平(1.1%)，說明試驗結果可信度高;用處理 3) 減去處理 2)中 13CO2產生量，進一步計算亞硝酸型厭氧甲烷氧化(n-DAMO)速率。

　　1.4 熒光定量 PCR 分析

　　用 Fast DNA Spin kit for soil 提取試劑盒 (MP Biomedicals, USA) 提取土壤樣品中的總 DNA。取部分 DNA 提取液用分光光度計(NanoDrop ND-1000 UVVis)測定 DNA 濃度和純度。土壤 DNA 保存于-80℃冰箱待用。在 CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad 公司)擴增儀上進行熒光定量 PCR 擴增。測定土壤樣品中總細菌和 M. oxyfera 菌的 16S rRNA 基因拷貝數。總細菌基因擴增所用引物為細菌 V4+V5 高變區通用引物 515F/907R;M. oxyfera 菌擴增所用引物為 qP1F/qP1R。反應體系為 20.0 µL，包括 DNA 樣品 1.0 µL， Premix TaqTM 10 µL，前后引物各 1.0 µL，超純無菌水 7.0 µL。擴增條件為：預變性 95 ℃，10 min;變性 95 ℃，30 s;退火 55 ℃，30 s;延伸 72 ℃，30 s; 40 個循環。根據質粒梯度濃度制成的標準曲線計算目的基因的拷貝數。

　　1.5 數據統計與分析

　　用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析，通過單因素方差分析及多重比較、相關性分析(Pearson)進行土壤理化性質、氧化速率、微生物豐度的差異性以及相關性檢驗，顯著水平 α = 0.05。

　　2 結果與分析 2.1 不同類型稻田土壤的理化性質

　　南京稻田和崇明圍墾稻田土壤理化性質如表 1 所示。南京稻田表層土壤中總有機碳(TOC)、總氮(TN)、NH4 +、NO3 -的含量均顯著高于深層土壤，表明農業施肥、農作物生長等對耕層土壤有機質和 N 水平影響很大。崇明圍墾稻田中表層土壤 TOC 顯著高于深層土壤，而 TN、NH4 +、NO3 -的含量在表層和深層之間無明顯差異，且圍墾稻田這些指標均顯著低于南京稻田對應土層，說明圍墾稻田受土壤母質、成土化進程等影響，其土壤肥力普遍低于內陸稻田。相反，圍墾稻田中表層和深層土壤的 SO4 2-含量、EC 值和 pH 值均顯著高于南京稻田，表明圍墾區稻田仍具有明顯的海洋性特征。

　　2.2 稻田土壤的 13CO2豐度變化和 CH4厭氧速率

　　本試驗中，培養瓶密閉氣體中 13CH4 的起始質量分數約為 10%，隨著厭氧培養的進行將轉化為 13CO2，根據其質量分數和豐度變化與培養時間進行計算，可得出培養時間內的平均 n-DAMO 速率。圖 1 結果顯示，兩種類型土壤在只供應 Ar 氣體條件下厭氧培養后，其土壤 13CO2 豐度保持在自然豐度水平(1.08%);在供應 13CH4和 13CH4+NO2 -條件下，土壤 13CO2豐度均有不同程度的升高，表明所試兩種土壤均發生了甲烷厭氧氧化反應。其中，只供應 13CH4 條件下 13CO2豐度顯著高于 Ar 處理，表明土壤中存在本底性電子受體可促進甲烷厭氧氧化過程。在供應 13CH4+NO2 -條件下，13CO2豐度顯著高于 13CH4處理，表明兩種所試土壤均發生了以 NO2 -為電子受體的厭氧 CH4氧化作用。在此底物供應條件下，南京稻田土壤 13CO2 豐度達 4.57%～5.87%，明顯高于圍墾稻田的對應土層(4.12%～4.69%)，暗示了南京稻田土壤可能具有較大的 NO2 -型厭氧 CH4 氧化潛力。圖 2 結果顯示，南京稻田表層(NJ10)和深層(NJ60)土壤的 CH4厭氧氧化速率分別為 3.51 和 2.45 µmol 13CO2·g-1·d-1，圍墾稻田表層(WK10)和深層(WK60)土壤的 CH4 厭氧氧化速率則分別為 1.43 和 1.36 µmol 13CO2·g-1·d-1。可以看出，南京稻田表層土壤的 CH4 氧化速率比圍墾稻田高出 59%，而深層土壤則高出 44%，表明濱海圍墾稻田的亞硝酸鹽型 CH4 厭氧速率均顯著低于內陸南京稻田。

　　2.3 稻田土壤中 M. oxyfera 菌和總細菌的 16S rRNA 基因豐度

　　目前認為，以 NO2 -為電子受體的 CH4 厭氧氧化過程由 NC10 門中的 M. oxyfera 細菌催化進行。南京稻田表層中 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數為 4.82×107 copies·g-1，比深層土壤的基因拷貝數高出 1.1 倍(圖 3)。圍墾稻田表層中 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數為 2.12×107 copies·g-1，比深層土壤的基因拷貝數高出 1.4 倍。可以看出，南京稻田 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數顯著高于圍墾稻田土壤。

　　對稻田土壤總細菌的 16S rRNA 基因拷貝數進行了測定。其變化范圍為 2.12-3.13×108 copies·g-1，比 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數高出 1 個數量級。其中，南京稻田耕層土壤的總細菌 16S rRNA 基因拷貝數顯著高于其它三個土樣。將 M. oxyfera 細菌與總細菌的 16S rRNA 基因拷貝數相比，可得出 M. oxyfera 細菌的相對豐度。發現南京稻田耕層和深層土壤 M. oxyfera 細菌相對豐度為 1.5%和 0.9%，圍墾稻田則分別為 0.9%和 0.4%。

　　2.4 厭氧 CH4氧化速率與基因豐度和理化性質的相關性分析

　　對厭氧 CH4氧化速率與 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數進行相關分析，結果表明，亞硝酸型厭氧 CH4氧化速率與 M. oxyfera 細菌的 16S rRNA 基因豐度呈顯著正相關(圖 4)，說明功能微生物的數量很大程度上決定了土壤 CH4 厭氧氧化能力。

　　對厭氧 CH4 氧化速率與土壤理化性質進行回歸分析，結果表明，土壤 CH4 厭氧氧化速率與土壤 TOC、TN、NH4 +、NO3 -的含量的回歸方程均達到了顯著水平(表 2)，說明土壤 C、N 水平是影響 CH4厭氧氧化潛力非常重要的環境要素。相反，土壤 SO4 2-含量、EC 值與厭氧 CH4 氧化速率呈負相關，但未達到顯著水平。值得注意的是，土壤 pH 值與厭氧 CH4 氧化速率呈負相關，且回歸方程達到了顯著水平。這些結果說明圍墾稻田土壤的海洋性特征仍較明顯，對厭氧 CH4氧化潛力具有一定的抑制作用。

　　3 討論

　　本試驗采用 13CH4 同位素標記法證實了在濱海圍墾稻田和內陸南京稻田均發生了亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用。本研究使用的 13CH4 的豐度為 99%，而且起始質量分數高達 10%，這樣可以最大程度地降低厭氧培養過程中 CH4 產生過程對試驗結果的影響，具有較高的可信度。而且，本厭氧培養試驗設置了只加 Ar 的對照處理，既可測試試驗過程是否保持嚴格厭氧狀態，又可測定厭氧過程 CH4 產生過程特征。結果顯示，所試兩個土樣在培養過程中 CH4 產生量極低，可以忽略不計。因此，本研究采用 13CH4 同位素標記法測出的 n-DAMO 速率能客觀真實地反映出土壤的厭氧 CH4 氧化潛勢。其中，圍墾稻田土壤的 n-DAMO 速率高于杭州灣濱海自然濕地的氧化速率(0.2～1.3 nmol 13CO2 g -1 d -1)[14]，表明圍墾植稻熟土化過程會促進亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用。南京稻田土壤的 n-DAMO 速率與內陸淡水濕地的氧化速率基本一致(1.8～3.6 nmol 13CO2 g -1 d -1) [7]，表明內陸稻田與淡水濕地均表現出較高的 n-DAMO 速率。

　　不同土壤母質、不同環境條件下發育形成的稻田，受理化性質、母質類型、農田管理等因素影響，可能對土壤 CH4 氧化潛力產生重要影響。本研究發現，內陸性南京稻田的亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化速率顯著高于濱海圍墾稻田。南京稻田的成土母質為河流沉積物，黏粒比例較高，同時也形成了較為穩定的土壤團聚體，有利于提高土壤肥力[15]。在種植水稻過程中施 N 量和有機肥量較高，使得該所試土壤的有機碳、全氮含量較高。相反，圍墾稻田的成土母質是長江口泥沙沉積物，砂粒較粗，蓄水保肥能力差[16]，且在水稻生長過程中，地上部生物量小，根系生物量及分泌物量低，土壤的有機碳和 N 水平較低。本試驗表明，土壤 TOC 和總 N 水平與厭氧 CH4 氧化速率顯著正相關，可見土壤本底 C、 N 水平反映了土壤的 C、N 轉化過程的基本特征，對土壤厭氧 CH4 氧化潛力有著極其重要的影響。這與 Shen 等[14]的研究結果一致，他們認為濕地土壤硝化和反硝化作用強烈，其中間產物 NO2 -可以為 M.oxyfera 菌提供底物促進 CH4 氧化過程。而且南京稻田中 TOC 含量高，可為反硝化微生物提供較多碳源，促進反硝化作用，有利于為 M.oxyfera 菌提供底物 NO2 -。相關性分析發現，n-DAMO 速率與土壤 EC 值、SO4 2-含量均呈顯著負相關。這與 Wang 等[10]的結果一致。圍墾稻田土壤中 SO4 2-含量比南京稻田高出一個數量級，EC 值也顯著高于南京稻田，這些海洋性特征參數可能也是造成圍墾稻田厭氧 CH4 氧化速率低的重要原因。這與 Li 等[13]的研究結果一致，他們認為，較高的鹽度會導致 n-DAMO 細菌細胞內較高的滲透壓，不利于細胞新陳代謝;而且鹽度高會直接抑制亞硝酸還原酶、一氧化氮歧化酶的活性[17]。不僅如此，較高的 SO4 2-含量本身可以作為電子供體，介導硫酸鹽型厭氧 CH4 氧化作用，對亞硝酸鹽型厭氧 CH4 氧化過程具有抑制效應[18]。

　　本試驗中，圍墾稻田土壤 M.oxyfera-like 細菌的 16S rRNA 基因拷貝數為 (0.89～2.12)×107 copies·g-1，其變化范圍與杭州灣濱海和長江口灘涂濕地的數量級一致[10,14]，且顯著低于南京稻田。不僅如此，M.oxyfera-like 細菌的相對豐度也表現為圍墾稻田明顯低于南京稻田。相關性分析發現，M.oxyfera-like 細菌的基因拷貝數與 n-DAMO 速率、土壤總氮和礦質態氮均呈顯著正相關，說明 M.oxyfera-like 細菌的數量及其活性等生物學特性是導致 n-DAMO 速率產生空間變異的主控因素。然而，有報道發現，內陸湖泊沉積物中，M.oxyfera-like 細菌的基因拷貝數與土壤 TOC、總氮和礦質態氮均呈顯著負相關，暗示除了土壤理化性質之外，可能還受到其它因素的重要影響，如厭氧氨氧化菌的競爭性生長等。說明 M.oxyfera-like 細菌在不同類型土壤中分布規律不盡相同，受控因素較多，有待深入研究。

　　本試驗發現，兩種類型的稻田中耕層土壤的厭氧 CH4 氧化速率均顯著高于深層土壤。此前在旱地農田和西溪濕地的研究中也有類似的報道。而且，本研究還發現 M.oxyfera-like 細菌的豐度表現未表層遠高于深層土壤。在之前的稻田土壤中也有報道 M.oxyfera-like 細菌僅分布在深層土壤中而在表層土壤中未能檢測到[12]。現已證實，M.oxyfera-like 細菌是嚴格厭氧類型，其自身可以內產氧方式滿足 CH4 氧化過程[19]，而環境氧分壓對其會有強烈抑制作用，體積分數為2%的氧氣可促使 n-DAMO 細菌失去活性。照此推測，分布在濕地深處的土層其厭氧 CH4 氧化潛力應高于表層土壤。例如，白洋淀湖泊沉積物中 M.oxyferalike 細菌豐度隨著深度增加有明顯的增加趨勢[20]。在杭州稻田的研究也有類似報道[7]。然而，對嘉興稻田 M.oxyfera-like 細菌的研究顯示，其表層(0～40 cm)豐度遠高于深層(40～100 cm)豐度[12]。除了氧分壓之外，亞硝酸型厭氧 CH4 氧化作用還受到許多其它因素的影響，如 CH4 底物濃度、NO2 -底物濃度、反硝化速率等。稻田耕層根系分布密度大，根際分泌物多，是稻田 CH4 產生的主要生境[21]。這種高分壓 CH4濃度是 CH4氧化微生物的重要底物，對亞硝酸型厭氧 CH4 氧化過程可能具有重要的促進作用。不僅如此，施加的 N 肥大部分進入稻田耕層，進行強烈的硝化和反硝化作用，在耕層會產生較多的 NOx -等中間產物，有利于 M.oxyfera-like 細菌獲取 NO2 -底物。研究發現，從熱力學角度來看， M.oxyfera-like 細菌介導的甲烷厭氧化反應的標準自由能釋放量遠遠低于反硝化菌介導的反硝化過程，在 NOx -等比較豐富而耕層稻田中其反硝化菌對 M.oxyfera-like 細菌的抑制作用較小，有利于亞硝酸型厭氧 CH4 氧化作用的進行，相反，在深層土壤中 NOx -等相對貧乏，M.oxyfera-like 細菌會收到反硝化微生物的強烈抑制，從而使得 NO2 -為底物的甲烷厭氧氧化速率減小。因此，本試驗中，土壤 TOC、N 水平對亞硝酸型厭氧 CH4氧化作用起著主導作用，從而導致其耕層土壤的氧化速率顯著高于深層土壤。

　　pH 值是影響土壤厭氧 CH4 氧化作用的重要因素[22]。本試驗發現兩者之間存在負相關關系。He 等[23]考察了不同 pH 條件下 M.oxyfera 細菌的甲烷氧化活性，發現其最適 pH 值是 7.6，暗示了該菌偏好弱堿性環境。本試驗中圍墾稻田土壤 pH 值盡管呈弱堿性，但是厭氧 CH4 速率遠低于南京稻田，可能的原因是土壤中高濃度的 SO4 2-離子也可作為電子受體參與甲烷厭氧氧化，具有底物競爭效應[18]。而且土壤本底 N 水平低，N 轉化產生的 NO2 -較少，在一定程度上也抑制了亞硝酸型厭氧 CH4氧化過程。

　　需要指出的是，稻田土壤 CH4 轉化過程及功能微生物群落結構會受到諸多因素的影響，如水稻生育期、施肥量、農田管理等。本研究選取了兩種不同類型的典型稻田進行比較，僅能代表所試稻田土壤的厭氧 CH4 氧化潛勢。在此基礎上，需要從不同氣候帶采集更多不同類型的稻田土壤，深入研究典型稻田厭氧 CH4 氧化作用的本質特征，為探索我國稻田溫室氣體減排措施提供科學依據。

　　4 結論

　　1)內陸性稻田土壤厭氧 CH4氧化速率顯著高于濱海圍墾稻田，其土壤 C、 N 水平和功能微生物豐度是造成兩種類型稻田產生差異的主要原因。

　　2)兩種類型稻田中，耕層土壤的厭氧 CH4氧化速率顯著高于深層土壤，其耕層土壤中功能微生物豐度高、活性氮豐富是 CH4氧化潛力較高的重要原因。