一、資料與方法

1.臨床資料

420例回族NSHL患者來自中國西北地區,包括寧夏、甘肅、青海、陜西和新疆五個省份部分地區特殊教育學校的306名聾啞學生和甘肅省回族聚集地的114例散發病例。420例患者均為來自不同家庭的耳聾先證者,無耳聾家系患者,其中先天性聾377例,語后聾43例;男233例,女187例,男女比例為1.26:1,年齡1～73歲(平均19.25±4.92歲)。其中一側重度聾、另一側極重度聾患者6例,雙側重度聾4例,中度聾1例,其余均為雙側極重度聾。

1）病史采集

所有研究對象以問卷調查和電話家訪的形式進行病史采集,內容包括:①一般情況:姓名、性別、年齡、婚姻狀況、出生日期、家庭住址、長期的聯系方式;②耳聾特點:發病年齡、有無聽力波動、有無伴隨眩暈及耳鳴癥狀、語言發育情況、助聽器佩戴情況;③用藥史:包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、小諾霉素及其他自覺用藥后對聽力有影響的藥物、用藥劑量和持續時間;④新生兒期高危因素:耳聾家族史、孕期宮內感染、顱面畸形、高膽紅素血癥、腦膜炎、新生兒期缺氧缺血性腦病史、Usher綜合征及Waardenburg綜合征;⑤家族史:父母是否近親結婚、有無耳聾及其他疾病家族遺傳史;⑥智力發育情況;⑦母親分娩史:有無臍帶繞頸、難產及產傷。對有家族史的患者繪制相應的家系圖譜。

2）體格及聽力檢查

全身體格檢查:對全身各系統、器官及智力和生長發育進行全面的檢查,尤其是甲狀腺,排除因其他系統異常所致的綜合征型聾;②專科查體:排除耳部畸形和化膿性中耳炎等引起的非感音神經性聾;③聽力學檢查:應用丹麥生產的Madsen520便攜式聽力儀和美國智聽公司SmartEP聽覺誘發電位儀對研究對象分別進行純音測聽(puretoneaudiometry,PTA)和／或聽性腦干反應(ABR)檢查。并根據世界衛生組織(WHO,1997)標準將耳聾程度分為5個等級:正常≤25dBHL;輕度聾26～40dBHL;中度聾41～60dBHL;重度聾61～80dBHL;極重度聾≥81dBHL。

3）血樣采集及資料保存

在經研究對象或其監護人簽訂知情同意書后,抽取患者5～10ml靜脈血,注入存有2mlEDTA抗凝劑的試管中,20oС保存。利用王秋菊等[3]建立的遺傳性聾資源收集、保存和利用的綜合系統對上述內容建立詳盡的病案資料。

2.基因檢測方法

1）基因組DNA的制備

用鹽析法提取全血基因組DNA,TE溶解,1%瓊脂糖凝膠電泳定性、定量并利用分光光度計進行濃度和純度檢測。制備50～100ng／μl工作液,4oС保存備用。

2）目的片段的擴增和酶切

利用多聚酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)對GJB2第2外顯子、線粒體DNA及SLC26A4第8、19外顯子進行擴增并使用A1w26I內切酶對線粒體基因進行酶切反應,將線粒體酶切陽性標本及另外兩基因目的片段送生物公司進行測序。

3）測序結果判讀

將生物公司反饋的測序結果利用SequenceScannerv1.0和SeqMan與來自NCBI的標準序列(mtDNA:NC＿012920.1;GJB2:NG＿008358.1;SLC26A4:NT＿007933.15)進行對比,確定突變位點。

二、結果

1.mtDNA1555A＞G突變檢測結果

420例耳聾患者中,11例為mtDNA1555A＞G均質性突變所致,占檢測人數的2.62%(11／420)。其中4例同時伴有其他位點的堿基改變,2例同時伴有1438A＞G+1598G＞A的點突變,另外2例同時伴有1438A＞G+1736A＞G的點突變。11例患者中6例(54.55%,6／11)有明確的氨基糖苷類抗生素用藥史。

2.GJB2突變檢測結果

420例患者中,41例為GJB2突變所致,包括24例純合突變和17例復合雜合突變,占所有耳聾患者的9.76%(41／420),是最常見的致聾基因(表1),c.235delC純合突變致病率最高(46.34%,19／41)。還有31例致病基因攜帶者,未發現顯性致聾基因,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840)。在420例患者中共檢測到14種突變形式,包括9種致聾突變(c.235delC,c.176191del16,c.299300delAT,c.35delG,c.109G＞A,c.439G＞A,c.187G＞T,c.310del14,380G＞A)、兩種常見多肽(c.79G＞A,c.341A＞G)及三種致病性不明確的突變(c.511G＞T,458G＞A,c.478G＞A,其中前兩種是本研究發現),詳見表2。c.235delC占所有致病等位基因的51.33%(58／113),是該地區回族NSHL患者的主要突變方式。

3.SLC26A4基因突變檢測結果

420例患者中共發現20例(7例為散發患者,13例為特殊教育學校的聾生)為雙等位基因改變(純合和復合雜合),占所有患者的4.76%(20／420)。在840個等位基因中有42個c.9192A＞G單等位基因改變,占5.0%(42／840),包括11例純合突變、14例雜合突變和6例與其他點突變共存的復合雜合(4例與c.2168A＞G共存、2例分別與c.1001+32A＞G和c.1001+5G＞C共存)。c.9192A＞G點突變在所有SLC26A4突變基因中占的比率最高(68.85%,42／61),是該地區人群的熱點突變(表3)。

三、討論

GJB2、SLC26A4及mtDNA1555A＞G三種常見致聾基因在不同人種、不同地域的耳聾人群中突變頻率和突變方式不盡相同。GJB2基因突變中,c.35delG是歐洲NSHL患者中最常見的突變形式,突變頻率在15%～55.8%之間[1];c.235delC是蒙古人種最常見的突變方式,在國內NSHL人群中c.235delC突變頻率約占GJB2等位基因的70%[4,5];SLC26A4基因突變中,c.2168A＞G(p.H723R)是日本人群中的主要突變方式,占SLC26A4等位基因的53%[6];我國以IVS72A＞G最為常見[4,7],內陸和臺灣IVS72A＞G的突變頻率分別占64.63%[8]和84%[9];mtDNA1555A＞G的檢出率低于青海省(5.76%)[10]和西北地區總體NSHL人群的檢出率(5.21%)[11]。本研究通過對三種常見聾病基因的聯合篩查明確了本組西北地區回族約17.14%(72／420)NSHL患者的病因。

本研究在420例回族NSHL患者中共發現41例(9.76%,41／420)例GJB2突變致聾病例和31例致病基因攜帶者,GJB2致病等位基因占所有等位基因的13.45%(113／840),較Dai等[5]報道的2063例中國非綜合征型聾患者的檢出率略低。c.35delG是高加索人種的主要突變形式,Li[12]和滿榮軍等[13]報道在新疆維族發現該突變,而在漢族人群未發現該突變,本研究中有6例患者發現c.35delG等位基因突變(2例純合、2例與c.299300delAT構成復合雜合、2例與c.235delC構成復合雜合)(表1),突變頻率較高,占所有致病等位基因的7.08%(8／113),可能與回族的種族起源有關。有研究顯示[14],回族人群與高加索人種的混雜度很高。本研究結果說明,GJB2基因突變是西北地區回族NSHL患者的主要致病突變,由于回族婚配的局限性,族內近親結婚率較高,因此通過婚育指導可在一定程度上降低該地區耳聾的發病率。
SLC26A4是大前庭水管綜合征(enlargeves-tibularaqueductsyndrome,EVAS)的主要致病基因,在國內以c.919A＞G和c.2168A＞G為其主要突變方式[15,16]。因此本研究針對上述兩個突變位點所在的外顯子進行檢測分析,結果示c.9192A＞G突變頻率為5.0%,介于國內不同地區的發病率之間(0.04%～19.9%)[17]。本組中有114例散發耳聾患者,其中7人為雙等位基因改變,占散發患者的6.14%(7／114),高于特殊教育學校聾生的檢出率(4.25%,13／306),分析其可能原因為:EVA患者聽力有波動性,散發病例中患者耳聾程度不一,有佩戴助聽器的患者和語后聾而未能就讀于特殊學校的患者;Wang等[15]在對95例EVA患者基因型與表型的研究中發現SLC26A4所致的耳聾表型以重度聾最常見(多數為IVS72A＞G突變所致),中度聾次之,極重度聾較少,而特殊教育學校的學生絕大多數為重度和極重度聾患者,故散發病例中的檢出率較特殊教育學校學生中高。目前國內外耳聾研究對象多以聾啞學生為主,而很少以散發耳聾患者作為研究對象,而同一地區、同一民族散發患者與特殊教育學校的患者SLC26A4突變率是否相同,聾啞學生的突變率是否可以反映整個地區的突變率,均有待于進一步研究。

mtDNA1555A＞G突變是氨基糖苷類抗生素相關致聾基因,中國西北地區由于經濟落后,該類抗生素使用廣泛,明顯高于國內其他地區[4,18]。本研究中11例為mtDNA1555A＞G均質性突變所致,占檢測人數的2.62%(11／420),與Guo等[4]報道的303例回族患者的檢出率相近,與漢族患者無統計學差異。由于線粒體母系遺傳的特點,加之種族起源和抗生素在不同地區使用廣泛程度不同,使得該基因在不同種族、不同地區的致病率有很大的差異。本組11例mtDNA1555A＞G基因突變患者中,6例有明確的氨基糖苷類抗生素用藥史,占病因明確患者的54.55%(6／11),因此,減少該類抗生素的使用對防止藥物性聾具有至關重要的作用。

本研究通過對三種常見聾病基因的聯合篩查,將為中國西北地區回族NSHL人群在耳聾基因診斷、遺傳咨詢及用藥指導等方面提供分子流行病學依據。由于本研究只針對GJB2、mtDNA155A＞G及SLC26A4基因的熱點突變進行了研究,僅明確了17.14%回族NSHL患者的遺傳學病因,在此研究的基礎上擴大基因篩查范圍、完善SLC26A4其余外顯子的基因檢測,有望為更多的NSHL患者帶來福音。（本文表略）

本文作者：馬建鸝 徐百成 邊盼盼 楊小龍 劉曉雯 李倩 朱一鳴 縱亮 趙亞麗 郭玉芬