鼻咽癌放療患者血清miR-196a表達的臨床意義

　　摘要：目的：MicroRNAs(miRNAs)屬于非編碼蛋白基因,是一類負調控基因表達的小RNA,血清中miRNAs具有重要臨床意義。為探討miR-196a在NPC中表達的臨床意義,本研究分析血清miR-196a表達水平與NPC放療反應的相關性。方法：收集選取中南大學湘雅醫院2010年6月—2019年6月接受調強放療并有完整隨訪資料的NPC患者138例作為研究的實驗組,同期選取來院健康檢查的正常人62例作為對照組。對照組采集空腹靜脈血,所有患者均于放療前采集空腹靜脈血,實時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清miR-196a表達水平;分析血清miR-196a高表達與NPC患者臨床分期及無病生存期(DFS)的相關性。以實體瘤變化和隨訪結果為評判標準,根據療效將患者分為A組(放療癌灶完全緩解)和B組(放療癌灶部分緩解+放療癌灶穩定進展);進而分析血清miR-196a表達水平與NPC療效的關系。結果：138例NPC患者miR-196a在血清中高表達122例(88.41%);其中86例臨床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表達81例,16例臨床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表達14例,36例臨床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表達27例;各組NPC血清miR-196a表達與正常對照組比較,差異均具有統計學意義(P均<0.01)。按放療效果分析,86例A組患者,血清miR-196a高表達71例(82.56%);52例B組患者,血清miR-196a高表達51例(98.08%),包括穩定進展19例(100.00%,19/19)和部分緩解32例(96.97%,32/33);A、B兩組血清miR-196a高表達比較,差異具有統計學意義(P<0.01)。A組患者中位DFS(36個月)明顯高于B組患者中位DFS(10個月),差異具有統計學意義(P<0.01)。結論：血清miR-196a高表達提示臨床NPC放療預后不佳,該基因有望成為NPC預后的血清生物標志物。

　　本文源自中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2020,26(04):405-409.《中國耳鼻咽喉顱底外科》雜志，于1995年經國家新聞出版總署批準正式創刊，CN:43-1241/R，本刊在國內外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：臨床報道、病案報道、綜述等。

　　鼻咽癌為我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一,具有明顯區域聚集性,在中國南部地區發病率較高[1]。我國NPC發病率和死亡率均高于全球平均水平[2]。NPC早期癥狀不明顯,且癌灶隱匿于鼻咽腔內,所以臨床NPC早期診斷有一定難度[3]。臨床NPC最后確診時,約70%～80%已發生頸部淋巴結轉移甚至遠處轉移[4]。放射治療是臨床NPC首選的治療方法,放療能有效控制NPC病變。隨著調強放療的推進,NPC療效顯著,但放療后仍有30%出現遠處轉移和/或復發[5]。另一方面,NPC放療有較大的毒副反應。因此,放療療效是NPC研究的一個重要方向。

　　MicroRNAs(miRNAs)是一種短的(20～24nt)單鏈小分子RNA,在多種腫瘤中表達異常,而患者液體活檢的血清miRNAs是一種潛在的生物標志物[6]。目前miRNAs在腫瘤診治方面已取得了較大進展,血清miRNAs可以應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)進行分析。在qPCR中,目標核酸的起始拷貝數越高,則熒光增加越快。本研究應用相對定量qPCR的比較CT法評估基因表達水平。

　　MicroRNA-196a(miR-196a)是由兩個基因組位點HOXC(人類的Chr12,基因MIR196A2)和HOXB(人類的Chr17,基因MIR196A1)轉錄而來,分別位于HOX9的上游[7]。MiR-196a與癌癥發生發展密切相關,發揮一種致癌基因的作用。本研究旨在探討miR-196a在NPC中表達的臨床意義,分析人NPC血清miR-196a的表達差異以及與NPC放療反應的相關性。

　　1、資料與方法

　　1.1臨床資料

　　收集中南大學湘雅醫院2010年6月—2019年6月接受調強放療(68.0～73.6Gy)NPC患者臨床資料,分析隨訪結果選取138例NPC患者作為研究的實驗組,包括男86例,女52例;年齡35～73歲,中位發病年齡為49歲。根據AJCC(第八版)NPC臨床分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期36例,Ⅲ～Ⅳ期86例。138例均為非角化癌(未分化型)。另以來院健康體檢結果均正常者62例作為對照組,男37例,女25例;年齡38～71歲,中位年齡47歲。本研究經患者及本院倫理委員會同意。

　　1.2治療方法及血液收集

　　本研究入選的NPC臨床資料和隨訪結果齊全,138例均為單純接受調強放療(68.0～73.6Gy/30～33次,2.1～2.3Gy/次)的NPC患者。對照組62例采集空腹靜脈血;實驗組138例NPC患者均在放療前采集空腹靜脈血;采集后的靜脈血首先置于4℃,靜置2h;然后低溫離心機4℃低速離心10min(2000g)取上清液;所有血清均離心取上清后保存于-80℃備用。

　　1.3血清總RNA提取

　　首先分取400μL血清,加600μL的Trizol,混勻后再靜置10min;再加200μL的氯仿,振蕩15s后靜置15min;低溫離心機4℃下12000轉離心25min后取上清;然后異丙醇與上清液以等體積輕輕混勻,并室溫靜置10min,4℃下12000轉離心15min,棄上清留沉淀;加1mL無酶水配制的75%乙醇,輕輕混合再4℃離心5min(7000轉)棄上清留沉淀晾干,加入25μL無酶水溶解沉淀;以無酶水作空白對照測RNA濃度。

　　1.4總RNA逆轉錄

　　在冰上溶解提取的RNA,用逆轉錄酶把提取的RNA逆轉錄成cDNA:反應管分別加入1μg小分子RNA、PolyAPolymerase(2.5U/μL)1μL、1μL的RTaseMix、5μL的5×PAP/RTBuffer,用ddH2O(RNase/Dnasefree)補充至25μL,在37℃作用60min、85℃下5min滅活酶,即獲得逆轉錄產物。

　　1.5qPCR分析血清miR-196a表達

　　實驗在冰上進行:用雙蒸水稀釋miR-196a引物及隨機下游引物稀釋成2μΜ(U6的引物序列:CAAGGATGACACGCAAATTCG;hsa-miR-196a的引物序列TAGGTAGTTTCATGTTGTTGGG),設置U6為內參基因,通用反向引物(Universalprimer)QIAGEN試劑盒自帶,引物試劑盒均由銳博公司提供;用雙蒸水將上述逆轉模板cDNA按1:3稀釋。在EP管中混合下列試劑:10μL的2×All-in-OneqPCRMix、2μL的All-in-OneTMmiRNAqPCRPrimer(2μM)、2μL的UniversalAdaptorPCRPrimer(2μM)、1:3稀釋模板cDNA、0.4μL的50×ROXReferenceDye,用3.6μL雙蒸水補充至20μL;短暫離心,加入96孔qPCR板內離心:按表1設置qPCR反應程序完成miR-196a的qPCR分析。

　　表1血清miR-196aqPCR反應程序設置

　　1.6統計學方法

　　基因表達量的計算,采用2-CT法,計算出cutoff值。所有數據應用SPSS10.0統計軟件統計,以%表示所有計數資料,以χ2檢驗分析數據;以(x±s)表示計量資料以t檢驗分析數據,以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2、結果

　　2.1NPC患者血清miR-196a的表達

　　本研究應用相對定量qPCR的比較CT法評估基因表達水平,以比較CT法評估miR-196a基因表達高低,直接從qPCR儀器獲取相對定量數據。qPCR顯示NPC患者血清miR-196a以高表達為主,而正常血清miR-196a以低表達為主。當cutoff值為0.0813時:138例NPC患者血清miR-196a高表達122例(88.41%);而對照組62例血清中,僅6例miR-196a高表達(9.68%);兩組miR-196a高表達相比較,差異均具有統計學意義(P均<0.01);而兩組的性別、年齡相比較,差異均無統計學意義(P均>0.01)。

　　2.2患者血清miR-196a高表達與NPC臨床分期的關系

　　138例NPC患者miR-196a在血清中高表達122例(88.41%);其中86例臨床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表達81例,16例臨床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表達14例,36例臨床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表達27例;NPC患者各組血清miR-196a表達與正常對照組比較,差異均具有統計學意義(P均<0.01)。具體見表2、3。

　　表2NPC組各臨床分期與對照組的血清miR-196a表達情況比較(例)

　　2.3患者血清miR-196a高表達與NPC放療效果的關系

　　采用如上述qPCR的2-△△CT法標準分析NPC血清miR-196a表達,當cutoff值為0.0813時,高于該值為miR-196a高表達。本研究qPCR顯示放療后癌灶穩定進展的NPC患者(19例)所有血清均高表達miR-196a,因此我們按放療效果進行了miR-196a的表達分析。臨床上NPC放療后癌灶完全緩解(A組),提示放療效果相對較好;NPC放療后癌灶穩定進展患者,臨床提示其放療效果相對較差(B組);NPC放療后癌灶部分緩解患者,提示其療效介于兩者之間,但放療后癌灶部分緩解可能有癌細胞殘存,所以這些NPC歸于B組。MRI顯示A組完全緩解NPC患者腫塊對放療敏感,患者放療前后腫塊變化顯著(圖1a、b),而B組放療穩定進展NPC患者MRI顯示整塊繼續增大(圖1c、d);另一方面,血清樣本qPCR的溶解曲線為一個單一的吸收峰(圖2a)且擴增曲線較好(圖2b),提示該基因血清中穩定易于檢測;miR-196a高表達提前進入指數擴增期、如箭頭所指上升曲線居前(圖2b)。

　　根據NPC放療效果分析血清miR-196a高表達結果:A組完全緩解NPC的86例,71例患者血清miR-196a高表達(71/86,82.56%);B組19例穩定進展NPC患者均為miR-196a高表達(19/19,100.00%),以及B組33例部分緩解NPC患者高表達32例(32/33,96.97%),B組高表達共為51例(51/52,98.08%);兩組相比差異具有統計學意義(χ2=7.614,P<0.01)。完全緩解NPC患者中位DFS(36個月)明顯高于放療穩定進展NPC患者中位DFS(10個月)(P<0.01)。

　　表3NPC組各臨床分期的血清miR-196a表達情況比較[例(%)]

　　圖1影像學MRI檢測NPC患者放療前后腫塊變化,A組患者放療前NPC(a)紅色線圈內所示NPC腫塊(Ⅳ),放療12個月后復查(b)NPC腫塊完全緩解;B組患者放療前NPC(c)紅色線圈內所示為NPC腫塊,放療12個月后復查(d)紅色線圈內NPC繼續增大腫塊

　　圖2NPC血清一組樣本qPCR分析miR-196a表達的代表性結果

　　3、討論

　　非編碼微小RNA(microRNAs,miRNAs)是內源性的RNA分子,具有抑癌基因或癌基因的雙重作用,為18～25個核苷酸組成單鏈的RNAs,在調控細胞增殖、分化和凋亡等方面發揮重要作用[8]。非編碼miRNA可以靶向特定的編碼mRNA形成相對完整的互補結構,可導致靶向的mRNA被降解而負調控蛋白質翻譯過程[8,9,10]。不同種類的腫瘤具有不同的miRNAs表達譜,miRNAs表達譜與腫瘤特性相關。檢測miRNAs表達水平,可用于腫瘤療效評估和預后判斷,可作為腫瘤診斷的標志物[8,9,10]。

　　有研究顯示miR-196a在多種腫瘤中有癌基因的特性,在腫瘤發生發展中起重要作用。MiR-196被報道在各種惡性腫瘤中異常表達,包括黑素瘤[9]和食管癌[10]。研究者認為是消化道腫瘤的生物標志物[11]。本研究顯示miR-196a在正常人血清中低表達,而在NPC血清中高表達,與文獻報道的結果一致。研究也表明低氧誘導的miR-196下調可促進肝癌發生及促進肝癌轉移[12];miR-196a通過靶向IκBα促進轉移的結直腸癌[13]。我們進一步分析發現血清miR-196a高表達與NPC臨床分期相關,晚期NPC患者血清miR-196a高表達(94.19%)。這些結果提示miR-196a在NPC中同樣有癌基因特性,進一步驗證miR-196a的惡性特征。

　　目前血清miR-196a表達是否能影響NPC放療反應尚未見報道。Bao等[14]研究顯示血清miR-196a為非小細胞肺癌的無創檢測生物標志物。本研究分析顯示miR-196a高表達與放療效果有關,qPCR顯示放療后癌灶穩定進展的NPC患者所有血清均高表達miR-196a,而MRI顯示放療穩定進展NPC患者整塊繼續增大(從圖1c放療前,變成圖1d放療后);而血清miR-196a分析顯示放療穩定進展NPC患者該基因高表達(圖2b),因此提示NPC患者血清中miR-196a高表達,可能影響NPC放療效果,放療前血清miR-196a高表達是NPC患者放療的不利因素,但血清miR-196a參與NPC放療反應調控的機制尚不清楚,而且其調控的靶基因亦待深入研究。

　　在本研究中,我們對NPC血清中miR-196a表達進行了初步分析,初步結果提示miR-196a高表達可能是NPC無創檢測的一個血清特征分子,放療前NPC患者血清miR-196a高表達為NPC放療不利因素,提示NPC血清中miR-196a高表達者可能預后不佳。